Characterization of a θ-carbonic anhydrase from Thalassiosira pseudonana
- 주제(키워드) Cell-free protein synthesis , Carbonic anhydrase , Marine diatom , Enzyme kinetics , Carbon concentrating mechanism
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 정광환
- 발행년도 2026
- 학위수여년월 2026. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000082559
- UCI I804:11029-000000082559
- 본문언어 영어
- 저작권 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록(요약문)
Carbonic anhydrase (CA) 는 이산화탄소 (CO2) 를 중탄산 이온 (HCO3–) 로 가역적으로 전환하는 효소이다. 최근 CA 는 해양규조류와 미세조류에서 carbon concentrating mechanism (CCM) 과 CO2 고정에 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌으나, 이에 대한 효소학적 특성에 대한 연구는 여전히 제한적이다. 본 연구에서는 세포 배양 없이 단백질을 합성할 수 있는 Escherichia coli (E. coli) 추출물 기반 cell-free protein synthesis (CFPS) 시스템을 이용하여, 다양한 유형의 CA 중 CFPS 로 발현에 성공한 CA 에 대해 p-nitrophenol acetate 를 사용하여 효소 활성을 평가하였다. 그 결과, 22 가지 CA 중 15 가지가 CFPS 를 이용하여 성공적으로 발현되었으며, 이 중 가장 높은 효소 활성을 가지면서 그 효소 특성이 잘 알려지지 않은 Thalassiosira pseudonana 의 θ-type carbonic anhydrase 3 (TpθCA3) 를 추가 분석 대상으로 선정하여 연구하였다. TpθCA3 는 E. coli 에서 성공적으로 발현 및 정제되었으며, 정제된 TpθCA3 의 효소 반응 속도론적 특성을 조사하였다. 그 결과 TpθCA3 의 kcat / Km 은 40℃, pH 7.8 조건에서 38.4 M–1s–1 로 추정되었다. 흥미롭게도, TpθCA3 는 EDTA 가 있을 때도 효소 활성을 보였으며, 저해제인 acetazolamide (AZ) 가 있는 환경에서는 kcat / Km 이 34.6 M–1s–1 으로 도출되어 AZ 의 저해가 없었음을 시사했다. 이러한 결과는 널리 알려진 금속 이온 의존적 촉매 기작과 일치하지 않으며, TpθCA3 가 새로운 효소 활성 메커니즘을 가질 가능성을 제시한다. 본 연구는 CFPS 기반 고속 스크리닝 접근법을 제안함과 동시에, TpθCA3 의 효소학적 특성에 대한 새로운 이해를 제공하고자 한다.
more초록(요약문)
Carbonic anhydrase (CA) catalyzes the reversible hydration of carbon dioxide (CO₂) to bicarbonate (HCO₃⁻). Although CA has recently been recognized as a key component of the carbon-concentrating mechanism (CCM) and CO₂ fixation in marine diatoms and microalgae, its enzymatic properties remain poorly characterized. In this study, I used a Escherichia coli (E. coli)-lysate based cell-free protein synthesis (CFPS) system, which enables protein production without cell cultivation, to evaluate the expression potential and esterase activity of twenty-two CA candidates originating from diverse organisms. Among these, fifteen CAs were successfully expressed in E. coli, and Thalassiosira pseudonana θ- type CA3 (TpθCA3), for which exhibited highest enzyme activity and enzymatic properties remain largely uncharacterized, was selected for further analysis. TpθCA3 was successfully expressed and purified from E. coli, and its enzyme kinetic parameters were characterized. Under conditions of 40°C and pH 7.8, the kcat / Km value of TpθCA3 was estimated to be 38.4 M⁻¹s⁻¹. Interestingly, TpθCA3 exhibited esterase activity even in the presence of 100 mM EDTA. Moreover, TpθCA3 exhibited a similar kcat / Km (34.6 M⁻¹s⁻¹) even in the presence of the inhibitor acetazolamide (AZ). These observation does not align with the well-established metal ion-dependent catalytic mechanism of CAs, suggesting that TpθCA3 may employ an alternative enzymatic mechanism. Overall, this study introduces a CFPS-based high-throughput screening approach and provides new insights into the enzymatic characteristics of TpθCA3.
more목차
LIST OF FIGURES I
LIST OF TABLES II
LIST OF ABBREVIATIONS III
초 록 1
ABSTRACT 3
INTRODUCTION 4
MATERIALS AND METHODS 9
Sequence alignments and phylogenetic analysis of CAs 9
Plasmid preparation 9
Cell-free protein synthesis (CFPS) Method 11
Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of the
post-reaction mixture 12
Esterase activity screening 12
Structural prediction of TpθCA3 13
Expression and purification of CA at E. coli 14
SDS-PAGE and western blot analysis 15
Esterase assay of TpθCA3. 15
Enzyme kinetics assay 16
RESULTS 17
Screening of carbonic anhydrase expression using CFPS 17
Screening of carbonic anhydrase exhibiting high esterase activity 19
Prediction of metal binding residues TpθCA3 22
Heterologous expression of recombinant TpθCA3 in E. coli 25
TpθCA3 has esterase activity without zinc ion 26
Enzyme kinetics study of TpθCA3 28
DISCUSSION 30
REFERENCES 33
