dCas9-Driven Sequence-Specific DNA Labeling for Optical Mapping
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 조규봉
- 발행년도 2026
- 학위수여년월 2026. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 화학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000082397
- UCI I804:11029-000000082397
- 본문언어 한국어
- 저작권 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록(요약문)
본 연구에서는 기존 nicking enzyme 기반 optical mapping 이 가지는 서열 제약성과 DNA 손상 문제를 극복하기 위하여 CRISPR-dCas9 을 이용한 새로운 서열 특이적 DNA 표지 플랫폼을 구축하였다. dCas9 은 guide RNA(gRNA)에 의해 지정된 모든 서열에 결합할 수 있어 기존 방식으로는 표지 불가능했던 다양한 서열에 대해 직접적인 광학 분석을 가능하게 한다. 그러나 선행 연구에서는 낮은 결합 효율과 높은 off-target 결합으로 인해 기술적 완성도가 제한적이었다. 이에 본 연구는 반복서열을 의도적으로 타겟팅하거나, 비반복 서열에서는 multi-gRNA 설계 전략을 적용함으로써 dCas9 기반 optical mapping 의 정확도와 신뢰도를 크게 향상시키고자 하였다. 반복서열(TTTAGGG)을 포함한 pWY82 plasmid 에 본 시스템을 적용한 결과, on-target 신호가 크게 증가하여 결합 효율 99%, off-target 0%의 높은 정확도를 확보하였다. 반복서열이 존재하지 않는 M13 DNA 에서 단일 gRNA 를 사용하였을 때에는 낮은 신호 강도와 평균 72% 수준의 결합 효율을 보였으나, 표적 영역에 3 개의 gRNA 를 연속 배치하는 multi-gRNA 전략을 적용한 결과 결합 효율은 약 95%로 크게 향상되었다. 본 전략은 인간 유전체에서도 유효하였다. Yq12 반복서열(HSat3, HSat1B)을 타겟팅한 결과, 서열 특성에 따라 단일 또는 multi-gRNA 방식이 모두 성공적으로 동작하였으며, 실제 매핑 비율은 유전체 내 Yq12 구성 비율과 일치하였다. 또한 본 플랫폼을 생물학적으로 처리된 샘플에도 적용하여, HIV 매개 GFP 유전자 삽입 세포주의 gDNA 분석에서 MOI 증가에 따른 dCas9 기반 형광 신호의 증가를 확인함으로써 시스템의 실용성을 검증하였다. 마지막으로 dCas9 이 표지된 DNA 를 주사전자현미경(SEM)으로 관찰하여 형광 현미경 대비 높은 분해능을 갖는 고정확도 optical mapping 플랫폼으로 확장하였다. 반복서열 및 유전체 전역에 산재한 Alu 서열에 대한 dCas9 표지 결과가 SEM 에서 성공적으로 관찰되었다. 본 연구는 반복서열 타겟팅 및 multi-gRNA 기반 신호 증폭 전략을 통해 dCas9 optical mapping 의 정확도와 적용 범위를 크게 확장하였으며, SEM 기반 고분해능 분석 플랫폼으로의 확장을 통해 dCas9 매핑 기술의 새로운 활용 가능성을 제시하였다.
more목차
1. Introduction - 8
2. Materials and Methods - 12
3. Results and Discussion - 18
4. Conclusion -36
5. References -38
