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The Role of ACSL1 Ubiquitination in the Regulation of Hepatic Lipid Metabolism

  • 송황엽 (Hwang Yeop Song, 서강대학교 일반대학원)

초록 (요약문)

대사이상 지방간질환은 전 세계적으로 높은 발병률을 보이는 만성 간질환으로, 간에서의 지방 대사에 이상이 생기면서 간 조직 내 지방이 과도하게 축적되면서 발병한다. 초기 단계인 간에 지방이 과도하게 축적되는 단순 지방간 상태에서는 증상이 보이지 않지만, 지방간 상태가 장기간 지속될 경우 염증반응이 일어나는 지방간염으로 이어진다. 지방간염의 지속은 간섬유화, 간경변, 간암 등 심각한 간질환의 원인이 된다. 하지만 간의 과도한 지방 축적을 유도하는 분자적 기전은 여전히 명확하게 알려져 있지 않다. 장쇄지방산-CoA 리가아제 (ACSL1)은 긴 사슬 지방산을 에너지원으로 활용하기 위해 CoA와 결합시키는 효소이며 간에서 긴 사슬 지방산을 저장 또는 산화 경로로 유도하는 데 중심적인 역할을 하고 있다. 이는 세포 내 소기관 위치에 따라 조절될 수 있음이 제안되고 있으나, 그 조절 기전과 간에서의 ACSL1이 지방 대사에 어느 측면에서 중요하게 작용하는지 명확하게 밝혀지지 않았다. 본 연구는 ACSL1 결핍 쥐를 이용하여, 간에서 ACSL1이 지방 대사에 미치는 영향과 ACSL1의 특정 라이신 잔기에서의 유비퀴틴화가 효소의 기능에 미치는 영향을 조사하였다. 이번 연구 결과는 ACSL1의 262번 라이신과 264번 라이신에 돌연변이를 일으켜 유비퀴틴화를 억제하게 되면 ACSL1의 안정성과 세포 내 위치 변화에 영향을 줄 수 있다는 것을 보여주고 있다. 이 결과는 간 내에서의 지질 대사 기전에 대해 이해하고, MASLD 치료를 위한 새로운 타겟을 발굴에 기여할 수 있을 것으로 기대된다. 주제어: 장쇄지방산-CoA 리가아제, 유비퀴틴화, 안전성, 세포 내 위치 변화

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초록 (요약문)

Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) is a prevalent chronic liver disease worldwide, characterized by excessive lipid accumulation in hepatocytes due to dysregulated lipid metabolism. While simple steatosis in its early stage is often asymptomatic, prolonged lipid accumulation can progress to steatohepatitis, ultimately leading to cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. However, the molecular mechanisms underlying hepatic lipid accumulation remain incompletely understood. Acyl- CoA synthetase long chain family member 1 (ACSL1) catalyzes the conjugation of long- chain fatty acids to CoA, facilitating their utilization in β-oxidation or lipid storage. This process is hypothesized to be regulated by its subcellular localization. Nonetheless, the mechanisms governing ACSL1 localization and function in hepatocytes are not fully elucidated. Purpose of this study is to investigate the metabolic role of ACSL1 in the liver using ACSL1 knock out mice and examined the impact of ubiquitination on ACSL1 function by introducing lysine-to-arginine mutations at K262 and K264(K261, K263 for human). These findings demonstrate that inhibition of ubiquitination at these lysine residues alters the subcellular localization and stability, thereby affecting hepatic lipid metabolism. These results provide novel insights into the molecular regulation of lipid metabolism in the liver and suggest ACSL1 ubiquitination as a potential therapeutic target for MASLD. Key words: ACSL1, ubiquitination, stability, subcellular localization

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목차

Abstract ⅷ
Introduction 1
Materials and Methods. 4
Mice 4
Plasmids 4
Cell culture 4
Chemicals 4
Site directed mutagenesis 5
Immunoblotting 5
AAV in vivo overexpression 6
Primary hepatocyte isolation 6
Cycloheximide chase assay 7
Fatty acid uptake analysis 8
BSA-palmitate solution 8
Radiolabeled palmitate solution 9
Fatty acid oxidation assay 9
Re-esterification assay 10
Crude mitochondria isolation 11
Immunofluorescence 11
RNA isolation and quantitative reverse transcription polymerase chain reaction
(qRT-PCR) 12
Statistical analysis 12
Results
Phenotyping hepatic lipid metabolism in liver-specific ACSL1 knockout mice 15
ACSL1 knock out hepatocytes exhibit reduced lipid metabolic activity 20
Liver-specific deletion of ACSL1 results in altered expression of lipid metabolism–related genes 23
Loss of ACSL1 does not compromise mitochondrial integrity 28
Fasting promotes the translocation of ACSL1 to mitochondria 31
Lysine-specific ubiquitination of ACSL1 is required for proper lipid metabolic function 33
Site-specific ubiquitination at K262 contributes to the post-translational control of ACSL1 stability 36
K264 ubiquitination regulates the subcellular trafficking of ACSL1 to mitochondria 40
The K262R ACSL1 mutant disrupts lipid metabolism without impairing ACSL1 enzymatic activity 43
Hepatic overexpression of the K262R-mutated ACSL1 impairs lipid metabolic processes in vivo 45
Discussion 50
References 54

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