The Self-renewal Function of Oct-4 Can Be Replaced by the EWS-Oct-4 Fusion Protein in Embryonic Stem Cells
- 주제어 (키워드) EWS-Oct-4 , EWS , Oct-4 , Oct-4 replacement , Self-renewal , Embryonic stem cell
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 김정호
- 발행년도 2025
- 학위수여년월 2025. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 실제 URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000081727
- UCI I804:11029-000000081727
- 본문언어 한국어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권 보호를 받습니다.
초록 (요약문)
Octamer-binding transcription factor 4 (Oct-4)는 배아줄기 세포(embryonic stem cell, ES cell)의 자가재생능력(self-renewal)과 다능성(pluripotency) 유지에 필수적인 전사인자로 잘 알려져 있다. 구조적으로 유사한 동족 전사인자인 Oct-1, Oct-2, Oct-6 등이 존재하지만, 이들은 ES 세포에서 줄기세포 특성을 유지 또는 콜로니 형성에 있어 Oct-4의 기능을 대체하지 못한다. 또한 핵수용체 Nr5a2는 세포 리프로그래밍 과정에서 일시적으로 Oct-4를 대체할 수 있으나, 장기적인 ES 세포 특성 유지에는 한계가 있다. 본 연구에서는 인간 Ewing 육종에서 발생하는 t(6;22)(p21;q12) 전위를 통해 EWS 유전자의 N-말단 저복잡성 도메인과 Oct-4 유전자의 DNA-결합 POU 도메인이 결합된 EWS-Oct-4 융합단백질을 대상으로 하였다. 이 융합단백질은 야생형 Oct-4보다 강력한 전사 활성능을 가지며, 줄기세포의 특성을 유지하거나 증진시킬 가능성이 있다. 이를 위해 테트라사이클린 조절 시스템을 통해 Oct-4의 발현이 억제되도록 설계된 ZHBTc4 ES 세포를 사용하였으며, EWS-Oct-4의 기능적 특성을 평가하기 위해 western blot, 면역세포화학 (immune cytochemistry), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), luciferase 리포터 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 기형종 형성(teratoma formation) 실험 등 다양한 분석 기법을 적용하였다. 그 결과, EWS-Oct-4는 Oct-4 결손 상태의 ES 세포에서도 미분화된 형태의 콜로니를 유지하게 하였으며, Sox2, Nanog, SSEA-1 등의 다능성 마커 발현을 증가시켰다. 또한, 세포 증식을 촉진시키는 동시에 세포 주기 억제인자인 p21의 발현을 감소시켰으며, Oct-4의 대표적 표적 유전자들인 Rex-1과 FGF-4 등의 발현을 유의하게 증가시켰다. 이러한 결과는 EWS-Oct-4가 세포 주기 조절 및 다능성 유지에 직접적인 역할을 수행할 수 있음을 시사한다. 한편, EWS-Oct-4 발현 세포에서는 상피세포 마커의 발현이 증가하고 간엽세포(mesenchymal) 마커는 감소하였으며, 이는 상피세포적(epithelial) 표현형으로의 전환이 일어났음을 나타낸다. EWS-Oct-4는 생체 내에서도 기형종 형성을 유도하였으며, 이를 통해 in vivo 기능성이 추가로 검증되었다. 이러한 효과는 EWS-Oct-4의 구조적 완전성과 특정 기능 도메인에 의해 결정됨을 확인하였다. 추가적으로 수행한 전사체(transcriptome) 분석 결과, EWS-Oct-4와 Oct-4를 각각 발현하는 세포들은 전체 유전자 발현 프로파일에서 높은 유사성을 보였으며, 일부 유전자의 발현만이 차이를 나타내는 것으로 확인되었다. 이러한 전사 수준의 유사성은 EWS-Oct-4가 Oct-4의 핵심 생물학적 기능을 상당 부분 대체할 수 있음을 뒷받침한다. 본 연구는 EWS-Oct-4가 Oct-4의 주요 기능을 효과적으로 수행할 수 있는 기능적 대체 인자로 작용함을 제시하며, 이는 줄기세포 연구 뿐만 아니라 세포 운명 결정, 재생의학 및 종양생물학 분야에서 새로운 기전을 이해하는 데 기여할 수 있는 중요한 단서를 제공한다.
more초록 (요약문)
Octamer-binding transcription factor 4 (Oct-4) is a transcription factor well known to be essential for the self-renewal and pluripotency of embryonic stem cells (ES cells). Although structurally similar homologous transcription factors such as Oct-1, Oct-2, and Oct-6 exist, they are unable to replace the function of Oct-4 in maintaining stem cell characteristics or supporting colony formation in ES cells. In addition, although the nuclear receptor Nr5a2 can temporarily substitute for Oct-4 during the reprogramming process, it has limited ability to maintain the long-term identity of ES cells. This study aimed to determine whether EWS-Oct-4, a fusion protein identified in human tumors, can act as a functional substitute for Oct-4 by maintaining or enhancing stem cell properties. To this end, ZHBTc4 ES cells, in which Oct-4 expression is suppressed under a tetracycline-regulated system, were used, and various analytical techniques such as western blotting, immunocytochemistry, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), luciferase reporter assay, flow cytometry, and teratoma formation assays were applied to evaluate the functional characteristics of EWS-Oct-4. As a result, EWS-Oct-4 was able to maintain undifferentiated colony morphology even in ES cells deficient in Oct-4 and increased the expression of pluripotency markers such as Sox2, Nanog, and SSEA-1. In addition, it promoted cell proliferation while reducing the expression of the cell cycle inhibitor p21, and significantly upregulated the expression of representative Oct-4 target genes, such as Rex-1 and FGF-4. These findings suggest that EWS-Oct-4 can play a direct role in the regulation of the cell cycle and the maintenance of pluripotency. Meanwhile, cells expressing EWS-Oct-4 showed increased expression of epithelial markers and decreased expression of mesenchymal markers, indicating a transition to an epithelial phenotype. EWS-Oct-4 also induced teratoma formation in vivo, further validating its functionality in a physiological context. These effects were determined by the structural integrity and specific functional domains of EWS-Oct-4. Additionally, transcriptomic analysis revealed that cells expressing EWS-Oct-4 and those expressing Oct-4 showed high similarity in global gene expression profiles, with only a small number of genes showing differential expression. This transcript-level similarity supports the conclusion that EWS-Oct-4 can substantially substitute for the core biological functions of Oct-4. This study suggests that EWS-Oct-4 acts as a functional substitute capable of effectively performing the major roles of Oct-4 and provides important clues that may contribute to the understanding of novel mechanisms not only in stem cell research but also in cell fate determination, regenerative medicine, and tumor biology.
more목차
1. LIST OF FIGURES
2. LIST OF ABBREVIATIONS
3. 국문초록(요약) 및 주제어(키워드)
4. ABSTRACT (ENGLISH)
5. INTRODUCTION
5.1. Transcriptional Regulation of Self-Renewal and Pluripotency in Embryonic Stem Cells
5.2. Chromosomal Translocation and Fusion Genes in Cancer
5.3. EWS Gene Structure and Fusin Protein Formation
5.4. Overview of Oct‑4’s Molecular Architecture and Biological Functions
5.4.1. Oct‑4 in Cellular Reprogramming and Substitute Factors
5.4.2. Oct‑4 in ES Cell Pluripotency and Self‑Renewal
5.4.3. Promoter Methylation-Driven Regulation of Oct-4 and the Emergence of EWS-Oct-4 in Tumors
5.5. Structure and Characteristics of the EWS-Oct‑4 Fusion Protein
5.6. TET-On and TET-Off Inducible Gene Expression Systems
5.7. ZHBTc4 ES Cells: Dox-Regulated Oct‑4 Null Model
5.8. Research Objectives
6. MATERIALS AND METHODS
7. RESULTS
7.1. EWS-Oct-4 can maintain the self-renewal potential of Oct-4-null ZHBTc4 ES cells
7.2. EWS-Oct-4 enhances proliferation of ZHBTc4 ES cells
7.3. EWS-Oct-4 downregulates p21 expression in ZHBTc4 ES cells
7.4. EWS-Oct-4 upregulates expression of key pluripotency markers in ZHBTc4 ES cells
7.5. EWS-Oct-4 upregulates epithelial marker expression and downregulates mesenchymal marker expression in ZHBTc4 ES cells
7.6. EWS-Oct-4 activates downstream target genes of Oct-4 in ZHBTc4 ES cells
7.7. EWS-Oct-4 expression leads to prominent teratoma formation by ZHBTc4 ES cells
7.8. The overall integrity of the EWS-Oct-4 fusion protein is crucial for supporting the proliferation and maintaining the morphology of ES cells
7.9. Specific domains within the EWS-Oct-4 fusion protein play critical roles in regulating the cell cycle of ZHBTc4 ES cells
7.10. Multiple domains of EWS-Oct-4 are involved in repressing p21 gene expression in ZHBTc4 ES cells
7.11. ES cells expressing EWS-Oct-4 and Oct-4 display a high degree of transcriptomic similarity, with key variations in DEGs
8. DISCUSSION
9. REFERENCES
