Characterization of Beta-Carbonic Anhydrase from Coccomyxa subellipsoidea through Mutagenesis
- 주제어 (키워드) Carbonic anhydrase , Coccomyxa subellipsoidea , Microalgae , Mutagenesis , Enzyme activity , Catalytic efficiency , Biomineralization
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 정광환
- 발행년도 2025
- 학위수여년월 2025. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 실제 URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000079688
- UCI I804:11029-000000079688
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권 보호를 받습니다.
초록 (요약문)
This study explores the role of Coccomyxa subellipsoidea C-169 Carbonic anhydrase (CA), specifically β-CA, in biomineralization and CO2 fixation. Biomineralization is a key process where microalgae convert CO2 and metal ions into stable metal carbonates, precipitating them in a way that contributes to sustainable environmental applications. Carbonic anhydrase plays a critical role in this process by catalyzing the reversible conversion of CO2 to bicarbonate (HCO3-), facilitating efficient carbonate precipitation. To investigate the importance of histidine residues in proton transfer and enzyme stability, all histidine sites in Coccomyxa CA were subjected to mutagenesis. The mutant enzymes were expressed as recombinant proteins in E. coli, and their activities were characterized using p-NPA assays. Michaelis-Menten kinetic parameters were compared between the WT and mutant enzymes to evaluate the effects of specific mutations on enzyme function and active site accessibility. The results revealed that certain histidine mutations increased catalytic efficiency by up to six-fold compared to the WT, while other mutations reduced enzyme activity and biomineralization efficiency. These findings confirm that histidine residues are essential for CA functionality. This study provides new insights into the molecular mechanisms of Coccomyxa CA and highlights its potential for industrial applications, such as CO2 fixation and rare metal recovery. It contributes to developing sustainable environmental technologies leveraging microalgae and enzyme engineering.
more초록 (요약문)
본 연구는 Coccomyxa subellipsoidea C-169 Carbonic Anhydrase (CA), 특히 Beta-CA 가 생광물화 및 CO2 고정 과정에서 수행하는 역할을 조사하였습니다. 생광물화는 미세조류가 CO2 와 금속 이온을 안정적인 금속 탄산염으로 전환하여 침전시키는 중요한 과정으로, 지속 가능한 환경 응용에 기여할 수 있습니다. Carbonic Anhydrase 는 이 과정에서 CO2 를 중탄산염(HCO3 -)으로 가역적으로 전환하는 반응을 촉매 하며 탄산염 침전을 효율적으로 유도하는 데 핵심적인 역할을 합니다. 본 연구에서는 Histidine residue 가 양성자 전달과 효소 안정성에 중요한 역할을 한다는 가설을 바탕으로 Coccomyxa CA 의 모든 Histidine residue 를 돌연변이 처리하였습니다. 야생형(WT)과 돌연변이 효소는 E. coli 에서 재조합 단백질로 발현되었으며, p-NPA 기반 효소 활성 분석을 통해 야생형(WT)과 돌연변이형 효소의 Michaelis-Menten 동역학 매개변수를 비교하여 돌연변이가 효소 기능과 활성 부위 접근성에 미치는 영향을 평가하였습니다. 연구 결과, 특정 Histidine 돌연변이는 야생형과 비교해 촉매 효율성을 최대 6 배까지 증가시키는 효과를 보였으며, 반대로 다른 위치의 돌연변이는 효소 활성과 생광물화 효율을 낮추는 결과를 나타냈습니다. 이를 통해 Histidine residue 가 CA 의 기능 수행에 필수적임을 확인할 수 있었습니다. 이러한 결과는 Coccomyxa subellipsoidea C-169 CA 의 분자적 메커니즘을 이해하고 CO2 고정 및 희소 금속 회수와 같은 산업적 응용 가능성에 대한 새로운 통찰을 제공합니다. 본 연구는 미세조류와 효소 공학을 활용한 지속 가능한 환경 기술 개발에 기여하고자 합니다.
more목차
INTRODUCTION 9
MATERIAL AND METHOD 14
Preparation of plasmid constructs of CsCA 14
Site-Directed mutagenesis by overlap PCR 14
Sequence Alignments and Phylogenetic Analysis of CsCA 16
Structural Prediction of CsCA 16
Expression and purification of CsCA 17
SDS-PAGE and Western Blot of CsCA 19
Enzyme Kinetic Assay using p-Nitrophenyl Acetate (p-NPA) 20
The kinetic analysis of CsCA with p-NPA 21
RESULTS 22
Phylogenetic Analysis of Carbonic Anhydrase 22
Multiple Sequence Alignments and Structure Prediction of CsCA and Conserved Zn binding site 24
Mutant Residues and Their Localization in the Oligomeric Structure 28
Expression and purification of CsCA WT and mutants 32
Enzyme reaction of p-NPA 36
Enzymatic Activity of CsCA WT using p-NPA Assay 37
Enzymatic Activity of CsCA WT and mutants (Histidine to Alanine) using p-NPA Assay 40
Enzymatic Activity of CsCA WT and mutants (Histidine to Lysine) using p-NPA Assay 45
Compared Enzyme kinetic parameters of CsCA 48
DISCUSSION 52
REFERENCES 56
