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The Quorum Sensing Molcule cyclo(Phenylalanine-Proline) Binds to the Pocket Site in the Interface Between the ToxR/ToxS Heterodimer to Conduct Signaling in Vibrio vulnificus

정족수 인식 분자인 cyclo(Phenylalanine-Proline)의 패혈증 비브리오균에서 신호 전달을 수행하기 위한 ToxR/ToxS 이합체의 접점에 있는 포켓 부위와의 결합

  • 김소이 (Kim Soyee, 서강대학교 일반대학원)

초록 (요약문)

Vibrio species use quorum sensing (QS) pathways to detect cell density and regulate gene expression for survival and pathogenicity. In the human pathogen Vibrio vulnificus, the autoinducer-2 (AI-2) signaling pathway is crucial for QS, influencing virulence genes. This study investigates the QS mechanism mediated by cyclo(phenylalanine-proline) (cFP) in V. vulnificus. We hypothesize that cFP binds to a pocket at the ToxR-ToxS interface. Structural analysis using AlphaFold, performed by the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, suggests cFP interacts with arginine 277 and phenylalanine 279 residues of ToxR. To validate this, I created the ToxRmt variant with point mutations at these two residues. Mutant strains exhibited significantly reduced expression of leuO, a ToxR/ToxS regulon member. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) analysis confirmed that the ToxRmt/ToxS complex has a lower affinity for the leuO promoter. I identified a consensus ToxR binding motif upstream of ryhB, encoding a regulatory sRNA and ChIP anlysis confirmed ToxR binding at this site. ToxR/ToxS- defective and wild-type strains harboring luxAB reporter genes fused to the ryhB promoter showed that RyhB expression is negatively regulated by ToxR/ToxS in the presence of cFP. Additionally, ToxR/ToxS signaling down-regulates luxS, the gene for the AI-2-producing enzyme via RyhB. LacZ assays demonstrated that RyhB positively regulates the csrA transcription, enhancing ToxR function. Interaction of RyhB with the 5' UTR of CsrA mRNA exposes the ribosomal binding site. In conclusion, cFP binding to the ToxR-ToxS interface modulates gene expression, altering AI-2-mediated QS signaling in V. vulnificus. This study reveals additional cFP-elicited signaling pathways, emphasizing their role in the pathogen's virulence.

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초록 (요약문)

비브리오 종은 세포 밀도를 감지하고 생존 및 병원성과 관련된 유전자 발현을 조절하기 위해 정족수 인식 회로 (Quorum Sensing; QS) 를 사용한다. 패혈증 비브리오균 (Vibrio vulnificus)에서 AI-2 (Autoinducer-2) 신호 전달 경로는 QS에 필수적이며, 이는 병원성 유전자에 영향을 미친다. 본 연구에서는 V. vulnificus 에서 cyclo(phenylalanine-proline) (cFP) 에 의해 매개되는 QS 메커니즘에 대해 알아보고자 했다. cFP 가 ToxR-ToxS 인터페이스의 포켓에 결합한다고 가정했고, 한국생명공학연구원의 AlphaFold 를 사용한 구조 분석에 따르면 cFP 가 ToxR 의 아르지닌 277 및 페닐알라닌 279 잔기와 상호작용하는 것으로 나타났다. 이를 검증하기 위해 두 잔기에 점 돌연변이를 가진 ToxRmt 변이를 생성했다. 돌연변이 균주에서 ToxR/ToxS 하위 조절 유전자인 leuO 의 발현이 현저히 감소했다. 크로마틴 면역 침강(ChIP) 분석을 통해 ToxRmt/ToxS 복합체가 leuO 프로모터에 대한 결합정도가 낮다는 것을 확인했다. 필자는 ryhB 상류에 ToxR 결합 부위를 확인하였고, ChIP 분석을 통해 ToxR 이 이 부위에 결합함을 확인했다. ryhB 프로모터에 luxAB 리포터 유전자를 융합한 ToxR/ToxS 결손 및 야생형 균주는 cFP 존재 하에 RyhB 발현이 ToxR/ToxS 에 의해 음성 조절됨을 보였다. 또한 ToxR/ToxS 신호는 RyhB를 통해 AI-2 생성 효소인 LuxS의 발현을 하향 조절한다.LacZ 분석을 통해 RyhB 가 csrA 전사를 상향 조절하여 ToxR 기능을 향상시키는 것을 확인했다. RyhB 와 CsrA mRNA 의 5' UTR 상호작용은 리보솜 결합 부위를 노출시킬 것으로 예측되었다. 본 연구에서 얻은 결과에 따라, cFP 가 ToxR- ToxS 인터페이스에 결합하여 유전자 발현을 조절하고, V. vulnificus 에서 AI- 2 매개 QS 신호를 변화시킨다고 추측된다. 이 연구는 cFP 에 의해 유발되는 추가 신호 경로를 밝혀내며, 병원균의 병원성에서 이 경로들의 중요성을 강조한다.

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목차

Ⅰ. Abstract 1
Ⅱ. Introduction 3
Ⅲ. Materials and methods 8
Ⅲ-1. Strains, plasmids, primers, and culture conditions 8
Ⅲ-2. Site-directed mutagenesis of toxR 9
Ⅲ-3. Construction of lacZ and luxAB transcription fusions 9
Ⅲ-4. β-Galactosidase assay 10
Ⅲ-5. ChIP analysis 10
Ⅲ-6. Bioluminescence assay 12
Ⅲ-7. Real-time PCR 13
Ⅲ-8. Detection of AI-2 production 14
Ⅳ. Results 18
Ⅳ-1. cFP facilitates the signaling activity of ToxR/ToxS heterodimer 18
Ⅳ-2. ToxR regulates the production of AI-2 production via RyhB 24
Ⅳ-3. Expression of CsrA is regulated by RyhB 32
Ⅴ. Discussion 36
Ⅵ. References 40

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