Attenuation of ToxR and Fur Expression in Vibrio vulnificus Using Designed Antisense RNAs
패혈증 비브리오균의 ToxR 과 Fur 단백질 발현을 억제하는 Antisense RNA 디자인
- 주제어 (키워드) Antisense RNA , Vibrio vulnificus , controlling virulence; 패혈증 비브리오균 , 병원성 조절
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 김건수
- 발행년도 2024
- 학위수여년월 2024. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 실제 URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000078903
- UCI I804:11029-000000078903
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권 보호를 받습니다.
초록 (요약문)
Synthetic antisense RNA (asRNA) has gained attention for its potent application in modulating the expression of target genes. However, efforts to target the expression of endogenous genes in microorganisms have been limited. This study aimed to design asRNAs targeting virulence factors in Vibrio vulnificus and test their effects. Firstly, I expressed asRNA targeting the luxA reporter gene under an arabinose-inducible promoter. The asRNA that successfully repressed the expression of LuxA was complementary to a 63 bp-long region of the target mRNA including Shine-Dalgarno and start codon. It had an engineered MicF Hfq binding site and a t0 rho-independent terminator at the 3′ end. Its predicted minimal folding energy was -56.29 kcal/mol. Considering these features, I designed asRNAs targeting ToxR and Fur, well-known regulators closely associated with the pathogenicity of V. vulnificus. The asRNAs effectively repressed the expression of target proteins and influenced the expression of OmpU, RyhB, and LuxS, which are regulated by ToxR or Fur. These results suggest that asRNAs could serve as tools to control virulence factors in microbial pathogens, pending further rigorous studies. Studies on the regulatory mechanisms of asRNA, refinements in asRNA design, and methods for transporting asRNAs are necessary.
more초록 (요약문)
합성 antisense RNA (asRNA)는 표적 유전자의 발현을 조절하는 강력한 도구로 주목받고 있으나, 미생물의 내인성 유전자 발현을 표적으로 하는 연구는 제한적이다. 본 연구는 Vibrio vulnificus 의 병원성 인자를 표적으로 하는 asRNA 를 설계하고 그 효과를 검증하는 것을 목적으로 했다. 우선, 아라비노스 유도 프로모터 하에서 luxA 리포터 유전자를 표적으로 하는 asRNA 를 발현시켰다. LuxA 의 발현을 성공적으로 억제한 asRNA 는 표적 mRNA 의 Shine-Dalgarno 서열 및 시작 코돈을 포함하는 63 bp 길이의 영역과 상보적이며, 3′말단에 MicF small RNA 의 Hfq 결합 부위와 t0 전사종결자를 가지고 있다. Minimal folding energy 는 -56.29 kcal/mol 로 예측되었다. 이러한 특징을 고려하여 V. vulnificus 의 병원성과 밀접하게 관련된 전사조절자, ToxR 과 Fur 를 표적으로 하는 asRNA 를 설계했다. 각 asRNA 는 표적 단백질의 발현을 효과적으로 억제하였고, ToxR 또는 Fur 에 의해 조절되는 OmpU, RyhB, 및 LuxS 의 발현에 영향을 미쳤다. 이러한 결과는 asRNA 가 미생물 병원체의 병원성 인자를 조절하는 도구로서의 잠재력을 가질 수 있음을 시사한다. 추후 asRNA 의 조절 메커니즘, asRNA 설계의 정밀화, 그리고 asRNA 를 표적 박테리아로 전달하는 방법에 대한 추가 연구가 필요하다.
more목차
1. Abstract １
2. Introduction ２
3. Materials and Methods ７
3.1. Strains, plasmids, primers, and culture conditions ７
3.2. Construction of the arabinose-inducible asRNA expression system ８
3.3. Transferring the asRNA expression system into V. vulnificus 11
3.4. Construction of the luxAB-transcriptional fusion to the toxR promoter 11
3.5. Measurement of bioluminescence 12
3.6. Real time quantitative PCR 12
3.7. Western blot analysis 14
4. Results 19
4.1. Developing strategies for the design of effective asRNAs in E. coli 19
4.2. Repression effect by the synthetic asRNA is exerted at the post-transcriptional level 26
4.3. Application of the asRNA expression system in V. vulnificus 29
4.4. Effects of the asRNA targeting ToxR in V. vulnificus 32
4.5. Effects of the asRNA targeting Fur in V. vulnificus 39
5. Discussion 48
6. References 53
