X-MAS (Cross-Mediated Allele Switching), Non-Mendelian inheritance through CRISPR-induced HDR between F1 alleles
- 주제어 (키워드) Allele-switching , CRISPR/Cas , HDR , Mendelian inheritance , X-MAS
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 이병하
- 발행년도 2024
- 학위수여년월 2024. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000077119
- UCI I804:11029-000000077119
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권 보호를 받습니다.
초록
다재다능한 유전자편집 도구인 CRISPR/Cas9 system은 gene drive와 같은 non- Mendelian 유전을 촉진시킬 수 있다. 한편, CRISPR/Cas의 사용에 있어서 transgene 없이 유전자를 변형하고자 하는 요구가 존재해 왔다. Mitalipov group 에서는 gene drive의 작동원리와 transgene-free 방법을 적용하여 수정 중인 oocyte에서 CRISPR/Cas에 의해 유전자 교정 (gene correction)이 발생할 수 있음 을 보인 바 있다. 여기서 유전자 교정이란 HDR (Homology-Directed Repair)을 위한 외부 유래 주형 없이 이형접합자로 존재하는 돌연변이 allele을 정상 동 형접합자쌍으로 교체하는 것을 의미한다. CRISPR에 의해 유도된 HDR에 의한 유전자 교정은 아직까지 식물에서 관찰된 바가 없었다. 이에, 본 연구에서는 애기장대에서도 CRISRP/Cas에 의해 유도된 HDR로 유전자 교정을 발생시킬 수 있는지 시도하였다. 이를 위해서 split-CRISPR/Cas system을 가지는 두 형질 전환체를 교배하였다: 한 형질전환체는 Cas9 effector (Cas9, nCas9 또는 AtRAD51nCas9)를 가지고 다른 하나는 교배상대가 가지는 Cas9 transgene을 겨 냥하는 sgRNA를 가진다. 획득한 F1 자손들 중 일부 F1 식물들이 “transgene- free”, 즉 Cas9 transgene이 제거된 것이 밝혀졌고, 이는 CRISPR에 의해 유도된 HDR로 인해 transgene allele이 정상체 allele로 교체되는 현상에 의한 것으로 추 정되며, 이를 X-MAS (Cross-Mediated Allele Switching) 라고 명명하였다. 그 후 F2중 Cas9 transgene을 보유하는 개체는 없었으며, 이를 통해 X-MAS가 F1 세대 에서 실제로 발생했음이 증명되었다. 이러한 X-MAS는 추후 연구에서 T-DNA 의 제거와 정밀하고 가속화된 육종에 적용될 수 있을 것이다.
more초록
The versatile genome editing tools CRISPR/Cas9 systems have facilitated non-Mendelian inheritance such as Gene drive. Also, in the use of CRISPR/Cas, there have been demands to modify gene without any of transgene. Adapting Gene-Drive mechanism and transgene- free strategy in fertilizing oocytes, the Mitalipov group demonstrated that CRISPR/Cas9 can mediate Gene correction: switching heterozygous mutant alleles into homozygous WT alleles without any extra HDR template applied. The gene correction, using CRISPR- induced HDR, has never been realized in plants so far. Thus, I tested if CRISPR-induced HDR can mediate such Gene correction in Arabidopsis. To this end, I crossed two transformants harboring split-CRISPR/Cas system: One transformant contained Cas9 effector (Cas9, nCas9 or AtRAD51nCas9) transgene; and the other carried sgRNA that targets the Cas9 effector transgene from the mating partner. Among resulting F1 progenies, several F1 plants turned out to be “transgene-free”, presumably by switching transgene allele to WT allele via CRISPR-induced HDR, and I refer to this phenomenon as X-MAS (Cross-mediated allele switching). Subsequently, none of the F2 population showed Cas9 transgene alleles, suggesting that bona-fide X-MAS had occurred in F1 generation. This X- MAS may be applied to the removal of T-DNA and the accelerated precision breeding in further development.
more목차
INTRODUCTION 1
MATERIALS AND METHODS 5
Plant materials and growth conditions 5
Construct cloning and sgRNA design 5
Floral-dip transformation assay 6
Gene expression analysis 7
Tail-PCR 7
Gene copy number analysis 8
RESULTS 10
Comparison between gene correction in human embryos and X-MAS in Arabidopsis thaliana 10
Design and production of Cas9 construct and Cas9 construct transformants 12
Reveal the locations of transgene in Cas9 construct transgenic plants 15
sgRNA was designed to target basta resistance gene in Cas9 transgenic plants 18
WT allele homo F1 plants were detected after crossing between Cas9 construct in Col- 0 and sgRNA in Ler 20
Allele switching occurred in Cas9 in Col-0 sgRNA in Ler F1 22
X-MAS events confirmed in Cas9 in Col-0 sgRNA in Ler F2 27
Allele switching occurred in nCas9 in Col-0 sgRNA in Ler F1 30
X-MAS events confirmed in nCas9 in Col-0 sgRNA in Ler F2 33
DISCUSSION 36
REFERENCES 41
