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Development of simultaneous multiresidue analysis using solid-phase extraction and optimized glucuronidase enzymatic hydrolysis for 351 prohibit substances in sports doping

스포츠 도핑 금지 물질 351종에 대한 고상 추출 및 최적화된 글루쿠로니데이즈 효소 가수분해법을 이용한 동시 다중 잔류물 분석법 개발

초록

When athletes take performance enhancing drugs (PEDs), the substances themselves are rarely detected in urine and are mostly excreted in the form of conjugated glucuronic acid. To obtain accurate results for drug analysis, the glucuronide form must be converted back to its parent form using the enzyme glucuronidase. To optimize the extraction efficiency of glucuronides, different reaction conditions consisted of the pH of the extraction solvent, incubation temperature, and hydrolysis time, and solid phase extraction (SPE) was performed under the same conditions. Univariate studies were performed to evaluate the influence of each operational variable as the ratio of morphine area to peak area of morphine-3-β-d3 after hydrolysis. In addition, the column and mobile phase were optimized to improve the separation efficiency, which significantly enhanced the sensitivity to HIF stabilizers and certain polar substances. The results showed that the sensitivity was improved by at least 2-fold and up to 300-fold over previous assays for several banned drugs, including polar substances such as meldonium and oxilfrine. The developed method was validated for limit of detection (LOD), selectivity, reliability, stability, and matrix effects. The developed method was also used to analyze real doping samples and proved to be a reliable tool as no false negative or positive results were observed.

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초록

본 연구에서는 스포츠 도핑 금지 물질 351 종에 대해 고상 추출과 최적화된 글루쿠로니데이즈 효소 가수분해법을 이용한 다중 잔류물 동시 분석법을 개발하였다. 운동선수가 경기력 향상 약물(PED)을 복용할 경우, 이러한 물질 자체는 소변에서 거의 검출되지 않으며 대부분 공액 글루쿠론산 형태의 대사산물로 배설된다. 약물 분석의 정확한 결과를 얻으려면 글루쿠로니데이즈 효소를 이용하여 글루쿠로니드 형태를 모체 형태로 되돌려야 한다. 글루쿠로니데이즈의 추출 효율을 최적화하기 위해 다양한 반응 조건은 추출 용매의 pH, 배양 온도, 가수분해 시간으로 구성되었으며, 동일한 조건에서 고체상 추출(SPE)을 수행하였다. 단변량 연구를 수행함으로써 가수분해 후 모르핀-3-β-d3의 피크 면적 대비 모르핀 면적의 비율로 각 운영 변수의 영향을 평가하였다. 또한 분리 효율을 개선하기 위해 컬럼과 이동상을 최적화하여 HIF 안정제 및 특정 극성 물질에 대한 감도를 현저하게 향상시켰다. 그 결과 멜도늄과 옥실로프린과 같은 극성 물질을 비롯한 여러 금지 약물에 대해 이전 분석법보다 최소 2 배에서 최대 300 배까지 감도가 향상된 것으로 나타났다. 개발된 분석법은 검출 한계(LOD), 선택성, 신뢰성, 캐리오버 및 안정성에 대한 검증을 거쳤다. 개발된 방법은 실제 도핑 샘플 분석에도 사용되었으며 위 음성 또는 양성 결과가 관찰되지 않아 신뢰할 수 있는 도구임이 입증되었다.

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목차

Ⅰ. Introduction 1
Ⅱ. Materials and Methods 7
1. Chemicals and Reagents 7
2. Instruments 20
3. Samples preparation 35
A. Standard substances & Internal standard solution 35
B. Sample preparation procedure 36
4. Method validation 38
Ⅲ. Results and Discussion 38
1. Optimization of sample preparation 39
2. Method validation 58
3. Comparison to previously published method 72
Ⅳ. Conclusion 74
Reference 75

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