Roles of Csr small RNAs in regulation of cFP-mediated quorum sensing pathway in Vibrio vulnificus
패혈증 비브리오 균에서 Csr small RNA들의 cFP-매개 쿼럼센싱 회로 조절에 관한 역할
- 주제어 (키워드) Vibrio vulnificus , small RNA , Csr sRNAs , CsrA , quorum sensing; 패혈증 비브리오균 , 정족수 인식 회로
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 김건수
- 발행년도 2024
- 학위수여년월 2024. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000076677
- UCI I804:11029-000000076677
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권 보호를 받습니다.
초록
Small noncoding RNAs (sRNAs) play pivotal roles as regulators in various bacterial biological processes. In recent decades, the identification of bacterial small RNAs has revealed a crucial mechanism for regulating gene expression in response to environmental cues and physiological changes. Among human pathogens, Vibrio species have been identified to modulate their virulence through sRNAs such as RyhB and Qrrs, which are associated with the quorum sensing pathway that detects cell density. Additionally, iron, a well-established key factor in numerous biological processes, is linked to the quorum sensing pathway. In Vibrio vulnificus, quorum sensing pathways are cued by cyclo(Phenylalanine- Proline) and autoinducer-2 with RyhB and Qrrs contributing to the AI-2-mediated pathway. Another system involves CsrB/C/D sRNAs, which interact with a global posttranscriptional regulator known as CsrA (Carbon Storage Regulator). This study focused on investigating the role of Csr sRNAs in the quorum sensing pathway of V. vulnificus. In V. vulnificus, Csr sRNAs repress the expression of ToxR, while CsrA induces ToxR expression. Given the high homology among the three Csr sRNAs with the repetition of CsrA binding sites, and the absence of significant homology with other genes in their complementary sequences, I propose that Csr sRNAs repress ToxR expression by sequestering CsrA, which binds to toxR mRNA and stabilizes it. As cFP and Csr sRNAs have same target factor, ToxR, it was assumed that cFP and Csr sRNAs might be correlated with each other. It showed that the expression of three Csr sRNAs was induced by cFP in the presence of ToxR. These three Csr sRNAs showed different patterns of regulation. LeuO, a master regulator of V. vulnificus cFP-quorum sensing pathway, repressed CsrB expression through direct binding to its promoter region. Fur-iron complex regulates the expression of CsrC by directly binding to its promoter region. In this study, it appears that Csr sRNAs and factors in the cFP-mediated quorum sensing pathway mutually regulate each other's expression. The study suggests that Csr sRNAs may function as novel sRNA factors involved in cFP-mediated quorum sensing pathway. Additionally, the research uncovered that cFP serves as the environmental signal controlling the expression of Csr sRNA, a previously unknown regulatory mechanism.
more초록
Small noncoding RNA (sRNA)는 박테리아에서 다양한 생물학적 반응을 조절하는 중요한 요소이다. 많은 연구를 통하여 박테리아 sRNA는 환경 신호 및 생리에 대응하여 다양한 유전자 발현을 조절함이 밝혀졌다. 인간의 패혈증을 유발한다고 알려진 Vibrio 종들은 sRNA인 RyhB와 Qrr를 통해 세포 밀도를 감지하는 정족수 인식 회로(Quorum sensing; QS)에 관여하여 병원성을 조절한다. 다양한 생물 반응에 중요한 역할을 하는 철은 정족수 인식 회로와 관련 있다고 알려져 있다. Vibrio vulnificus에서는 cyclo(Phenylalanine-Proline) (cFP)와 autoinducer-2 (AI-2) 두 물질이 정족수 인식 회로의 신호 분자로 작용한다. 같은 Vibrio 종인 Vibrio cholerae는 cholerae autoinducer-1 (CAI-1), AI-2, 그리고 DPO가 작용하여 V. vulnificus와 평행적인 정족수 인식 회로를 가지고 있다. 또다른 경로에는 CsrB/C/D small RNA (sRNA)들이 관여하며 CsrA라 불리는 전사후조절자에 결합하는 특징을 갖는다. 본 연구에서는 Csr sRNA들의 V. vulnificus의 정족수 인식 회로에서의 역할에 대해 알아보고자 하였다. 본격적인 연구에 앞서 V. vulnificus 내의 Csr sRNA들의 존재와 전사개시점을 실험을 통해 확인하였다. V. vulnificus 내에서 Csr sRNA들은 상호작용적으로 ToxR 발현을 억제하였으며, CsrA는 ToxR 발현을 반대로 높이는 모습을 보였다. 세 Csr sRNA들의 유전자 상동성이 매우 높고 공통적인 CsrA 결합 부위의 반복성이 보이는 점을 토대로 V. cholerae와 유사하게 Csr sRNA들이 CsrA와 결합하여 격리시킴으로써 ToxR 발현을 조절한다고 판단된다. Csr sRNA들은 cFP에 의해 발현이 유도됨이 확인되었는데, 이는 ToxR이 존재할 때 나타나는 경향으로, 이를 통해 ToxR이 cFP에 의존적인 방식으로 Csr sRNA들의 발현을 조절한다고 판단되었다. Csr sRNA들은 서로 다른 cFP 매개 정족수 인식 회로 요소에 의해 발현이 영향받는 경향을 보였는데, CsrB의 발현은 V. vulnificus 정족수 인식 회로의 구성요소인 LeuO가 프로모터 영역에 직접 결합하여 억제되었으며, CsrC의 발현은 Fur-철이온 복합체가 직접적으로 프로모터 영역에 결합함으로써 억제됨을 보였다. 이를 바탕으로 앞서 확인한 전사개시점을 기반으로 Fur와 LeuO의 결합 부위를 예측하였다. 본 연구를 통해 Csr sRNA들이 V. vulnificus의 정족수 인식 회로에 주요 인자로서 참여하며 병원성을 조절하는데 기여함을 밝힘과 동시에, cFP가 그동안 밝혀지지 않았던 Csr sRNA들의 발현을 조절하는 환경신호의 하나임을 실험적으로 확인하였다.
more목차
Ⅰ. Abstract 1
Ⅱ. Introduction 3
Ⅲ. Materials and Methods 7
Ⅲ-1. Strains, plasmids, primers, and culture conditions 7
Ⅲ-2. Construction of the transcriptional lacZ reporter fusions to csrB, csrC, and csrD 7
Ⅲ-3. Construction of deletion in csrA, csrB, csrC, and csrD, and triple deletions in csrB/csrC/csrD in V. vulnificus 8
Ⅲ-4. β-Galactosidase assay 9
Ⅲ-5. Purification of Fur and LeuO proteins 10
Ⅲ-6. Gel Shift assay 11
Ⅲ-7. Primer Extension to determine transcriptional start sites of Csr sRNAs 13
Ⅳ. Results 18
Ⅳ-1. Identification of Csr sRNAs in V. vulnificus 18
Ⅳ-2. CsrA positively regulates the expression of ToxR 26
Ⅳ-3. cFP induces the expression of Csr sRNAs in a ToxR-dependent manner 31
Ⅳ-4. LeuO represses the expression of CsrB sRNA 39
Ⅳ-5. LeuO binds directly to the promoter region of csrB 42
Ⅳ-6. Fur represses the CsrC sRNA expression in the presence of iron 45
Ⅳ-7. Fur binds directly to the promoter region of csrC in the presence of Fe2+ 48
Ⅴ. Discussion 53
Ⅵ. References 62
