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Factors affecting the production of the extracellular membrane vesicles and the sRNA composition in them in Vibrio vulnificus

비브리오 패혈증균에서 세포외막소포의 생성과 그 내 sRNA 조성에 영향을 미치는 요인

  • 박정헌 (Park, Jeongheon, 서강대학교 일반대학원)

초록 (요약문)

Vibrio vulnificus is an infectious bacterium and has evolved various strategies to adapt to environmental changes and infect hosts. Previous studies have revealed that non-coding small RNAs (sRNAs) such as Qrr and RyhB play diverse roles in sensing population density and iron concentration, and subsequently modulating pathogenicity factors. Recent studies highlight the biological roles of outer membrane vesicles (OMVs) in various types of cells. I postulated that these structures play some roles as shuttles for small RNAs involved in intercellular interactions. Through this, I expected that it would be possible to develop a method to control gene expression in target cells by delivering anti-sense sRNA to target cells. I, first, studied chemical and physical conditions affecting the production of OMVs of V. vulnificus. The production of OMV was quantitatively and qualitatively assessed through western blot quantification of OmpU which is an outer membrane porin, dynamic light scattering measurement, and direct confirmation through TEM for extracellular contents in various conditions. The production of OMV was increased as cell culture enters the stationary phase. Effects of stress conditions, iron concentration, and hydrogen peroxide were marginal. Changes in temperature affected the timing of OMV formation, and changes in salt concentration affected the amount of OMVs. Treatment of cFP, EDTA, and polymyxin B, a type of antimicrobial peptide, increased the production of OMV. Furthermore, a study was conducted to investigate the expression of sRNAs in V. vulnificus and the specific sequences of sRNAs entering outer membrane vesicles (OMVs). Through next-generation sequencing (NGS), the nucleotide sequences and abundance of sRNAs in both the cellular fraction and OMVs were analyzed and compared. The results revealed the expression of sRNA homologs known from other pathogenic Vibrio species in V. vulnificus, along with the identification of six novel sRNAs. While no distinct differences were found in the nucleotide sequences of sRNAs entering OMVs compared to the intracellular sRNA fragments, it was observed that the sRNA fragments within OMVs were significantly shorter in length, and there were variations in the expression ratios of sRNA homologs.

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초록 (요약문)

병원성 세균은 환경을 신속하고 정확하게 감지하여 생존과 번식을 위해 다양한 전략을 채택합니다. 저희 연구실에서는 선행 연구를 통하여 Vibrio vulnificus, V. cholerae, V. parahaeymolyticus 등과 같은 병원성 비브리오 종들이 개체 밀도와 철 농도를 감지하고 이에 맞추어 병원성 인자를 조절하는 능력을 발견했습니다. 이러한 조절 메커니즘을 규명하는 과정에서 Qrr과 RyhB와 같은 non-coding small RNA (sRNA)들이 신호 전달 과정에 깊이 관여하며 그 동안 잘 알려지지 않은 많은 역할을 한다는 사실을 관찰하였습니다. 또한 최근 여러 연구진들의 연구를 통하여 세균들뿐 아니라 많은 세포들이 outer membrane vesicles (OMVs)를 생산하며, 이들은 매우 다양하고 중요한 생물학적 기능이 있다는 사실들이 계속 밝혀지고 있습니다. 저는 패혈증 비브리오균이 생산하는 sRNA가 세포-세포 간 상호작용에 있어서도 아직 알려지지 않은 많은 생물학적 역할을 할 것이라고 가정하였습니다. 또한 한편으로, 아직 연구가 잘 안된 비브리오균이 생산하는 OMVs를 통한 sRNA의 세포 간의 횡적 전달이 가능할 것이라 가정하였습니다. 이를 통하여 타겟 세포에 anti-sense sRNA등을 전달함으로써 타겟 세포의 유전자 발현을 조절할 수 있는 방법을 개발할 수 있을 것으로 기대하였습니다. 이러한 목적을 위해서 저는 기반 연구를 수행하였습니다. 우선 V. vulnificus로부터 OMV를 최대량으로 얻기 위하여 OMV 생산에 미치는 여러 요소들의 영향을 조사하였고, 이 결과를 바탕으로 OMV 최대 생산 조건을 확립하였습니다. 또한 V. vulnificus에서 어떠한 sRNA가 발현되는지 와 OMV에 들어가는 sRNAs가 가지고 있는 어떠한 특정의 공통점이 있는지를 조사하기 위한 연구를 수행하였습니다. 이를 위하여 세포 내 sRNAs과 OMVs 내에 들어간 sRNAs들을 Next generation sequencing (NGS) 기법으로 분석함으로써 그 염기서열과 각 sRNA들의 양을 분석하고 비교하였습니다. 그 결과 다른 병원성 비브리오 종에서 알려져 있는 sRNA 상동체들이 V. vulnificus에서도 발현됨을 확인할 수 있었고, 알려지지 않은 6종의 sRNAs를 확인할 수 있었습니다. 또한 OMV에 들어가는 sRNAs들에서 염기서열 상의 특이적인 차이는 발견할 수 없었으나 세포 내 sRNA 서열 단편에 비하여 OMVs에 들어간 sRNA 서열 단편들의 길이가 유의하게 짧고 sRNA 상동체의 발현 비율이 다른 것을 알 수 있었습니다.

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