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Visualization of Pathogenic DNA Sequences for Disease Diagnosis

질병 진단을 위한 병원성 DNA 염기서열 시각화

  • 황혜승 (서강대학교 일반대학원)

초록 (요약문)

최근 감염성 질환에 대한 관심이 높아지면서, 높은 정확도와 민감도로 단시간 내에 병원성 바이러스를 감지할 수 있는 시스템이 필요해졌다. 우리는 바이러스 RNA를 사용하여 이중 가닥 DNA를 합성하고, 이를 단일 분자 단위로 이미징 함으로써 새로운 현장 진단 시스템을 개발했다. DNA 분자는 형광 염료로 염색되고 현미경을 통해 시각화할 수 있다. 또한, 미세 유체 장치를 설계하여 DNA 분자가 장치 채널 내부에서 균일한 길이로 펴져서 관찰될 수 있게 하였다. 미세 유체 장치 채널 내부로 들어가 관찰된 DNA 분자 이미지를 촬영하여 DNA 길이 분포 데이터를 얻었다. 이 데이터를 사용하여 그린 길이 분포 히스토그램을 통해 바이러스 기반 이중 가닥 DNA가 적절한 길이로 합성됨을 확인할 수 있었다. 이 시스템을 HIV 환자의 혈액에서 추출한 바이러스 기반 샘플에 적용한 결과, 음성 대조군과 비교해 유의미한 분자 수와 길이 값을 갖는 DNA 분자가 검출되었다. 병원성 바이러스 보유군과 음성 대조군은 이미징 수 검출되는 DNA 분자 수 차이로 구분할 수 있다. 그러나 음성 대조군에서 Genomic DNA 및 합성 오류로 인한 DNA 분자가 관찰됨에 따라, 바이러스 RNA 기반 분자를 타 DNA 분자와 구분할 수 있는 근본적인 방법이 필요했다. 따라서 바이러스 RNA 기반 분자에만 특정 패턴을 부여하여 구분하는 방법을 제시하였다. DNA 염기서열에 대해 고유한 패턴을 띠도록 하기 위해, A/T-rich한 DNA 영역에 특이적으로 결합하는 형광 염료를 사용하였다. DNA 분자 합성 과정에 biotin-dUTP를 도입해서 biotin이 결합된 DNA 분자를 합성하고, 형광 단백질이 결합된 Streptavidin을 그 biotin에 결합시키는 방법으로 A/T-rich 영역을 염색하였다. DNA의 backbone을 다른 색의 형광 염료로 염색하면 dsDNA 분자를 두 가지 색으로 labeling할 수 있다. 합성 조건을 최적화해서, DNA와 RNA oligo를 프라이머로 사용해 biotinylated dsDNA를 역전사 합성할 수 있었다. 또한 두 가지 색으로 형광 패턴화된 분자만을 바이러스 기반 분자로 특정함으로써, 검출 방법의 정확도를 향상시킬 수 있었다. 해당 분석 방법을 인간 유전체 분석에 적용하고자 하였다. 백혈병을 비롯해, 유전자 변이나 전좌 등으로 인해 발병하는 질병이 있다. 해당 염기서열을 포함하는 DNA 분자를 합성하고 패터닝하는 방식으로 질병 유무를 확인할 수 있을 것으로 기대했다. 따라서 인간 백혈병 세포를 배양해 DNA를 추출한 뒤, 염기서열 일부를 PCR로 증폭하는 과정에 biotin-dUTP를 가했다. 현재 biotin이 결합된 인간 DNA 분자 합성 및 이미징에 성공하였다. 공정 최적화를 통해 반응 시간 단축 및 labeling 효율 증가에 성공하면, 이 진단시스템의 활용 범위는 크게 넓어질 것으로 기대하고 있다.

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초록 (요약문)

With the recent increase of interest in infectious diseases, we need the system that can detect pathogenic viruses in a short time with high accuracy and sensitivity. We developed a new diagnostic detection system by synthesizing double-stranded DNA with viral RNA and imaging these single DNA molecules. DNA can be stained with fluorescent dyes and visualized under fluorescent microscope system. In addition, a microfluidic device was designed so that the loaded DNA molecules were uniformly stretched inside the microchannel on the positively charged glass surface. We obtained DNA length distribution data by taking images observed inside the microchannel. We confirmed that the peak of the length histogram appears constant at the expected position. This result indicated that virus-based dsDNA molecules were synthesized to appropriate lengths. We applied this method to clinical samples extracted from the patient’s blood to experiment whether the same results are derived. Compared to negative control, viral dsDNA molecules were detected with significant molecular numbers and length values. Samples of patients with viruses and negative control samples were classified by the difference in the number of molecules detected, but we need a fundamental method to differentiate the real viral DNA molecules from contaminants and genomic DNA. Therefore, to give a specific pattern to viral dsDNA molecules, we proposed a new method of classifying viral RNA-based molecules by giving specific patterns. We used a fluorescent dye that specifically binds to the A/T-rich DNA regions. We introduced biotin-dUTP to the viral dsDNA synthesis process, allowing the fluorescent protein that is bound to Streptavidin to be stained at the corresponding sites of dsDNA. This is because biotin-dUTP binds to Streptavidin with a high affinity. We stained the DNA backbone with another fluorescent dye of different color, so that the dsDNA molecules could be labeled in two colors. By optimizing the synthesis conditions, we synthesized biotinylated dsDNA with quick reverse transcription process by using DNA and RNA oligo as a primer. We succeeded in labeling the viral dsDNA molecules in two colors. By specifying molecules representing the fluorescence patterns as the virus molecules, the accuracy of the detection method can be expected to be improved. We tried to apply this analysis method to human genomes. There are diseases such as leukemia that occur due to genetic mutations or translocation. We expected that these diseases could be diagnosed through the detection of the corresponding sequences. To obtain the progress, we cultured human leukemia cells and extracted DNA. We added biotin-dUTP to the PCR step with human DNA and succeeded in visualizing. We tried to shorten the reaction time and increase the labeling efficiency through optimization. Through the future experiments, the use of this new diagnostic system is expected to expand significantly.

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