Development of an automated online immunopurification assay for urinary insulin and insulin analogs using AF4-ESI-MS/MS
- 주제어 (키워드) insulin , insulin analog , online immunoaffinity purification , antibody based assay , asymmetric flow field flow fractionation , mass spectrometry , anti doping , 인슐린 , 인슐린 유사체 , 온라인 면역 정제 , 항체 기반 분석 , 비대칭성 흐름장 흐름 분획 , 질량 분석 반도핑
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 오한빈, 김기훈
- 발행년도 2023
- 학위수여년월 2023. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 화학과
- 실제 URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000070048
- UCI I804:11029-000000070048
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권 보호를 받습니다.
초록 (요약문)
In this study, we developed an online immunopurification assay for urinary insulin and its analogs using AF4-ESI-MS/MS. Insulin is known to have an anabolic effect that promotes excessive glycogen storage in muscle cells as well as an anti-catabolic effect that inhibits protein breakdown, which may have positive effects on athletic performance by improving muscular strength and endurance. Thus, World Anti-Doping Agency (WADA) has designated insulin and analogs as prohibited substances. Using online immunopurification of insulin and insulin analogs, it is possible to reduce the costs, time, labor, and variables associated with complex procedures. To carry out immunopurification, PVDF membrane and RC membrane embedded in AF4 were designed to immobilize and filter proteins, and the antigen-antibody reaction was controlled through the pH of the mobile phase. In order to optimize the assay, the sensitivity enhancement effect of Protein A and the optimal reaction time were examined. Immobilizing protein A to the membrane surface also improved the orientation of the antibody, contributing to the better response of the antibody to insulin and its analogs. It was found that the optimized times were 10 and 5 minutes, respectively, which resulted in significant time savings when compared to offline analysis. It was validated for limit of detection (LOD), linearity, matrix effect, intra-day precision and inter-day precision of the developed assay. In this study, an online immunoaffinity purification hyphenated mass spectrometry platform will be useful for the analysis of proteins within a variety of biological samples.
more초록 (요약문)
본 연구에서는 AF4-ESI-MS를 이용하여 소변 내 반도핑 물질인 인슐린과 그 유사체에 대한 온라인 면역 정제 분석법을 개발하였다. 인슐린의 다양한 작용 중 근육 세포에 과도한 글리코겐 저장과 단백질 분해 억제하는 동화작용과 항 이화작용은 근력과 지구력을 향상시켜 잠재적으로 경기 능력향상에 영향을 끼칠 수 있다고 알려져 있다. 이에 세계반도핑기구는 선수들에게 치료 목적 이외의 인슐린과 그 유사체들의 사용을 금지하였다. AF4-MS를 이용한 온라인 면역 정제 분석법은 기존 인슐린과 인슐린 유사체 약물 분석의 복잡한 절차에 대한 비용, 시간, 노동력을 감소할 수 있는 효율적인 분석법이다. AF4내 면역 정제를 위하여, PVDF멤브레인과 RC 멤브레인을 이용하여 단백질 고정 및 필터를 수행하도록 설계되었으며, 이동상의 pH를 조절하여 항원-항체 반응을 제어하였다. 결과적으로 면역 정제를 통한 인슐린과 유사체들의 질량 스펙트럼을 확인하였다. 분석법 최적화를 위하여 단백질 A의 영향과 반응 시간을 조사하였다. PVDF 멤브레인에 부착된 단백질 A는 항체의 방향성을 개선시켜 인슐린과 그 유사체와 항체 사이의 원활한 반응에 기여하였다. 최적화된 시간은 각각 10분과 5분으로 빠른 분석이 가능하였다. 개발된 분석법은 검출한계, 직선성, 매질 효과, 일내 정밀도, 일간 정밀도에 대해 검증되었다. 본 연구는 온라인 면역 친화성 정제-질량 분석 플랫폼을 기반으로 다양한 생체시료 내 단백질 분석에 도움이 될 것으로 기대된다.
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