Nanopore-Block Sequencing to Map the Protein-DNA Interactions and Measure Their Binding Affinity
- 주제어 (키워드) protein–DNA interaction , nanopore sequencing , nanopore-block-seq , bioChIP-seq , single-molecule visualization
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 조규봉
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 화학과
- 실제 URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000066866
- UCI I804:11029-000000066866
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권 보호를 받습니다.
초록
A nanopore with a diameter of one nanometer does not allow the passage of the protein-bound DNA fragments. Using this blockade, we developed a new approach of “nanopore-block sequencing” to map the protein–DNA interactions and measure their binding affinity. DNA-bound proteins are biochemically important because they regulate gene expression and epigenetic control. ChIP-seq and related sequencing-based methods for genome-wide mapping of the protein–DNA interactions have attracted considerable attention; however, current sequencing-based methods require lengthy sample preparation and expensive service from a sequencing facility. In contrast, nanopore-block sequencing can be performed in an individual laboratory in a few hours at a reasonable cost. Therefore, this approach has a high potential to replace expensive sequencing-based platforms and small-scale EMSA or FRET for protein–DNA binding analysis. Nanopore-block sequencing comprises three steps: cross-linking of a protein to DNA, random fragmentation by sonication, and nanopore sequencing. Because no antigen-antibody interaction is needed, it is possible to analyze most proteins if they have an affinity for the DNA molecules. The coverage depth profile demonstrates the presence of deep valleys, thus providing a map of the protein–DNA interactions. As the first demonstration of the use of nanopore-block sequencing, we analyzed Cro repressor binding to DNA, and the results were in good agreement with the data of single-molecule observations. Second, we performed nanopore-block sequencing to characterize a sequence-specific nicking endonuclease (Nb.BssSI). The results of analysis demonstrated the capabilities of the nanopore-block sequencing: generation of a map of Nb.BssSI, identification of a strand involved in the primary binding of the enzyme, and evaluation of different efficiencies of binding to eight target sites. In conclusion, nanopore-block sequencing is a simple, inexpensive, and promising platform for the studies of the protein–DNA interactions.
more초록
직경이 1 나노미터인 나노포어는 단백질이 결합된 DNA 조각의 통과를 허용하지 않는다. 우리는 이러한 DNA 통과 차단 형태를 활용하여, 단백질-DNA 상호 작용을 매핑하고 결합 친화도를 측정하기 위해 "nanopore-block sequencing"이라는 새로운 접근 방식을 개발했다. DNA 결합 단백질은 유전자의 발현 및 후성 유전적 조절에 관여하기 때문에 생화학적으로 중요한 의미를 가진다. 단백질-DNA 상호작용을 활용한 유전자 서열 전체 매핑을 위해 개발된 ChIP-seq 및 관련 시퀀싱 기반 방법들은 상당한 주목을 받아왔다. 그러나 현재의 시퀀싱 기반 방법은 시퀀싱 과정에서 샘플 준비 시간이 길고 서비스의 가격이 비싸다. 대조적으로, nanopore-block sequencing은 합리적인 비용으로 몇 시간 안에 개별 실험실에서 수행할 수 있다. 따라서 이 접근 방식은 단백질-DNA 결합 분석을 위해 값비싼 시퀀싱 기반 플랫폼과 소규모 EMSA 또는 FRET를 대체할 수 있을 것으로 예상된다. Nanopore-block sequencing은 단백질과 DNA의 가교결합, 초음파 처리에 의한 무작위 단편화, 나노포어 시퀀싱, 세 단계로 구성된다. 항원-항체 상호작용이 필요하지 않기 때문에 DNA 분자에 친화력이 있는 대부분의 단백질들에 대한 분석이 가능하다. Coverage depth profile은 단백질 결합 위치에서 깊은 골의 형태를 보여주므로 단백질-DNA 상호작용의 위치 정보를 제공한다. 우리는 nanopore-block sequencing 활용의 첫 번째 예시로 DNA에 대한 Cro repressor 결합을 분석했으며 그 결과는 형광현미경을 활용한 단일 분자 DNA 관찰 데이터와 잘 일치했다. 다음으로 서열 특이적 nicking endonuclease (Nb.BssSI)를 분석하기 위해 nanopore-block sequencing을 활용했다. 그 결과, nicking endonuclease 맵 생성, 효소의 1차 결합에 관여하는 가닥 식별, 8개 표적 서열에 대한 다양한 결합 효율 평가를 통해 nanopore-block sequencing의 능력이 입증되었다. 결론적으로, nanopore-block sequencing은 단백질-DNA 상호작용 연구를 위한 간단하고 저렴하며 유망한 플랫폼이다.
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