Enhancement of storage oil accumulation by WRINKLED1 and its modification in Nicotiana benthamiana leaves
WRINKLED1과 그 변형에 의한 담배 잎에서의 저장 오일 축적의 향상
- 주제어 (키워드) C. sativa , P. frutescens , TAG , WRI1 , IDR , PEST motif , substitution of amino acid
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 서미정
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 실제 URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000066661
- UCI I804:11029-000000066661
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권 보호를 받습니다.
초록 (요약문)
Vegetable oil is an essential resource for the human diet, a widely used biodiesel substitute for fossil fuels, and a key ingredient in cosmetics, detergents, and lubricants. Camelina sativa, which contains 35~45% oil (dry seed weight basis), is an emerging oilseed crop. WRI1 is a well-established key AP2/EREBP-type transcription factor that upregulates the expression of genes involved in glycolysis and fatty acid biosynthesis. In this study, three strategies were compared to increase the oil content. First, CsWRI1A was overexpressed in C. sativa under the control of seed-specific glycinin promoter. Total storage oil contents increased approximately 10% in one transgenic plant, but there were no significant differences in six transgenic lines compared with non-transgenic lines. There were increased contents of C16:0, C18:2, C20:2, and C22:1 and decreased contents of C18:0, C18:1, C18:3, C20:0, and C20:1 in transgenic seeds compared with non-transgenic seeds, respectively. Second, removal of the IDR3-PEST motif (CsWRI1A1-397) and mutation of four serine residues (CsWRI1A4SA(S398A,S401A,S404A,S407A)) enhanced TAG accumulation in N. benthamiana leaves compared with CsWRI1A (control). It appears that four serine residues (398, 401, 404, and 407 aa) of CsWRI1A IDR3-PEST contributed to the increased storage oil biosynthesis in vegetative leaves, suggesting that four serine residues may influence the CsWRI1A protein stability. Third, to find a new WRI1 gene, PfWRI1A and PfWRI1B were characterized in Perilla. PfWRI1A:eYFP and PfWRI1B:eYFP were transiently expressed in N. benthamiana leaves, and YFP signals were located in the nucleus of the cells. In addition, NbPl-PKβ1, NbKAS1, and NbFATA, known as WRI1 target genes, increased in tobacco leaves. Ectopic expression of PfWRI1A and PfWRI1B increased the levels of TAG content by approximately 2.9- and 2.7-fold, suggesting that PfWRI1s have the potential to enhance TAG accumulation in oilseed crops. In summary, it suggested that the IDR3-PEST in CsWRI1A influences the CsWRI1A protein stability, and four serine residues affect the TAG accumulation in tobacco leaves. PfWRI1A and PfWRI1B regulate the storage oil accumulation by upregulating the lipid biosynthesis metabolism in vegetable tissues, which shows that PfWRI1s have the potential to enhance the storage oil accumulation in oilseed crops. This study offers some promising lipid metabolism engineering applications to replace fossil fuels.
more초록 (요약문)
식물성 기름은 인간의 식생활에 필수적인 자원이며 화석연료의 대체재로 바이오 디젤은 물론 화장품, 세제, 윤활유 등으로 널리 사용되어 왔다. 건조 종자 중량당 35~45%의 기름을 함유하고 있는 Camelina sativa는 신흥 유지종자 작물이다. WRIKELD1(WRI1)은 해당과정과 지방산 생합성에 관여하는 유전자의 발현을 up-regulation하는 AP2/EREBP에 속하는 중요한 전사조절인자로 널리 알려져 있다. 본 연구에서는 오일 함량을 증가시키기 위해 세 가지 방법을 수행하였다. 먼저, 카멜리나 WRI1A (CsWRI1A)를 종자 특이적 glycinin promoter하에서 카멜리나에 과다 발현하였다. CsWRI1A 유전자가 카멜리나로 도입되었는지 확인하고자, genomic DNA를 이용하여 PCR 분석을 수행하였다. 형질전환체 종자 선별은 DsRed를 이용하였다. 형질전환체 종자의 총 지방산 함량은 1개의 형질전환 식물체에서 약 10% 증가했지만, 다른 6개의 형질전환체에서는 유의미한 차이가 없었다. 형질전환 종자에서 C16:0, C18:2, C20:2 및 C22:1의 함량은 non-transgenic Camelina에 비해 증가하였다. 반면, 형질전환 종자의 C18:0, C18:1, C18:3, C20:0 및 C20:1의 함량은 non-transgenic Camelina 종자에 비해 감소하였다. 이러한 결과를 통해, CsWRI1A의 과다 발현은 종자 지방산 조성을 변경했지만 종자 오일 함량의 유의한 증가를 일으키지는 않다는 것을 확인하였다. 둘째, CsWRI1A 단백질의 C-말단에 intrinsically disordered region 3 (IDR3)이 오일 축적에 관여하는지 조사하기 위해, IDR3-PEST motif가 없는 CsWRI1A1-397:eYFP 또는 IDR3-PEST motif에 4개의 serine (398, 401, 404, 그리고 407 aa)이 alanine으로 치환된 CsWRI1A4SA(S398A,S401A,S404A,S407A):eYFP, 그리고 11번째 serine을 alanine으로 치환한 CsWRI1AS11A:eYFP 벡터를 가지고 있는 Agrobacterium을 각각 N. benthamiana 잎에 주입하였다. CsWRI1A1-397:eYFP와 CsWRI1A4SA:eYFP의 YFP 신호는 CsWRI1A:eYFP (control)에 비해 각각 약 4배 및 2배 증가하였다. CsWRI1A1-397와 CsWRI1A4SA의 TAG 함량은 CsWRI1A에 비해 N. benthamiana 잎에서 각각 약 22%, 46% 증가였다. CsWRI1AS11A:eYFP는 eYFP 신호와 TAG 함량에서 CsWRI1A에 비해 큰 차이가 없었다. 종합하자면, CsWRI1A IDR3-PEST motif와 특히나, 4개의 세린 잔기(S398A, S401A, S404A, 그리고 S407A)는 식물 잎에서 오일 생합성 대사를 조절함으로써 TAG 축적을 증가시킬 수 있었다. 셋째, 새로운 WRI1 유전자를 찾기 위해 PfWRI1A와 PfWRI1B를 들깨에서 선별하였고, PfWRI1A:eYFP와 PfWRI1B:eYFP 벡터를 구축하여 N. benthamiana 잎에서 일시적으로 발현하여 세포 내 핵에 위치함을 밝혀냈다. Nile red 염색에 의해 TAG가 형성되었음을 확인하였고, 이후 TLC 분석을 통해 TAG 함량이 증가하였음을 확인하였다. 또한, 주입된 잎에서 WRI1의 target gene인 NbPl-PKβ1, NbKAS1, and NbFATA의 발현이 증가하였다. 이러한 발견은 PfWRI1s이 N. benthamiana 잎에서 오일 생합성을 up-regulation함으로써 TAG 축적을 향상시킨다는 것을 보여주었다. 정리하자면, CsWRI1A의 IDR3-PEST motif의 변형과 PfWRI1s은 식물의 조직에서 지질 생합성 대사를 up-regulation하여 오일 축적을 증진시켰다. 이러한 지질 대사 공학을 통해서 식물성 기름을 증가시킬 수 있으며 이는 화석 연료를 대체할 중요한 공학 응용에 기여할 수 있을 것이라 기대된다.
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