DNA looping by Anabaena sensory rhodopsin transducer (ASRT) by using single molecule FRET based DNA cyclization assay
- 주제어 (키워드) single-molecule FRET , Time-correlated single-photon counting , anabaena sensory rhodopsin transducer , ASRT , FRET-based cyclization assay
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 김도석
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 물리학과
- 실제 URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000066601
- UCI I804:11029-000000066601
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권 보호를 받습니다.
초록 (요약문)
Single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) is a powerful experimental method for measuring structural changes in DNAs and proteins. By attaching a fluorescent molecule to an appropriate position, the structural change of the target molecule can be observed in real time. In addition, since the DNA or protein to be observed is immobilized on the surface, it can easily change the experimental conditions just by putting a new buffer solution into the channel. However, despite these advantages, due to the limitation of the smFRET measurement range (~ 10 nm for Cy3-Cy5 pair), in many cases accurate structural information of the target molecule is required to design and perform an experiment. In this study, a new experimental design was proposed to overcome the limitation of the measurement range of the smFRET. Utilizing this new design in the experiment, we successfully observed bending of DNA by ASRT protein, to get the kinetic parameters and the modulation of this structural change at different salt conditions. Another limitation of smFRET is that the accuracy of the structural information is often compromised due to the width of the smFRET histogram. In the second part of this thesis, the origin of the width (noise) of the smFRET histogram was investigated. Fluorescence decay lifetimes of the Cy5 dyes attached to the same DNA construct as that used for smFRET were measured by TCSPC (time-correlation single photon counting) by varying the photon numbers. The noise of the fluorescence decay lifetime changed in a same manner as smFRET with the change in the photon number, ensuring the heterogeneity in the local environment is the main origin of the noise in the smFRET histogram. The FRET-based cyclization assay proposed in this thesis successfully observed protein-induced structural changes in DNA. We hope that the method described is applicable to other protein-aided bending and looping processes such as in nucleosome dynamics or in transcription pre-initiation complexes. In addition, the limits of the measurement accuracy in smFRET experiments and the causes were proposed by comparison with the fluorescence lifetime measurements of the same fluorescence molecules. We hope that this study will be helpful in designing new experiment and in understanding the origin of the noise of the single-molecule experimental data.
more초록 (요약문)
Single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET)은 DNA와 단백질의 구조적 변화를 측정할 수 있는 매우 유용한 실험 방법이다. 형광 분자를 표적 분자의 적절한 위치에 부착함으로써 측정하고자 하는 표적 분자의 구조적 변화를 실시간으로 관찰할 수 있다. 또한 관찰하고자 하는 DNA나 단백질이 표면에 고정되어 있기 때문에 새로운 완충용액을 채널에 넣는 것만으로 실험조건을 쉽게 변경할 수 있는 장점이 있다. 그러나 이러한 장점에도 불구하고 smFRET의 측정 범위 (Cy3-Cy5의 경우 ~ 10nm)의 제한으로 인해 많은 경우 실험을 설계하고 수행하기 위해서는 표적 분자의 정확한 구조 정보가 필요하다. 본 연구에서는 smFRET 측정 범위의 한계를 극복하기 위해 새로운 실험 설계를 제안하였다. 이 새로운 실험 설계를 적용하여 ASRT 단백질에 의한 DNA의 굽힘을 성공적으로 관찰하였으며, 추가적으로 다양한 염 조건에서의 ASRT 단백질의 구조적인 변화를 관찰하는데 성공하였다. smFRET의 또 다른 한계는 smFRET 히스토그램의 너비로 인해 구조 정보의 정확성이 손상될 수 있다는 것이다. 따라서 좀 더 정확한 실험을 위해 smFRET 히스토그램의 너비 (노이즈)의 원인을 밝혀내고자 하였다. smFRET에 사용된 것과 동일한 DNA 를 준비한 후 DNA에 부착된 Cy5 형광분자의 fluorescence decay lifetime을 측정 광자 수를 변경해가며 TCSPC (time-correlation single photon counting) 실험을 통해 측정하였다. 그 결과 Fluorescence decay lifetime의 노이즈는 광자 수의 변화에 따라 smFRET 실험의 결과와 같은 경향성을 보였다. 이는 smFRET 히스토그램에서 보이는 노이즈의 주요원인이 표적 분자들이 고정 되어있는 위치에서의 환경 (local environment) 이 다름으로써 생기는 것임을 보여준다. 우리는 제안한 FRET-based cyclization assay가 뉴클레오솜 역학 (nucleosome dynamics) 또는 전사 사전 개시 복합체 (transcription pre-initiation complexes)와 같은 단백질에 의한 DNA의 구조변화 연구에 도움을 줄 수 있을 것이라고 생각한다. 더불어 fluorescence decay lifetime을 통한 smFRET의 noise 연구의 결과가 새로운 실험을 설계하고 단분자 실험 데이터의 노이즈의 기원을 이해하는 데 도움이 되기를 바란다.
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