Development of Phosphate FRET-based sensor by a genetic code expansion technique
- 주제어 (키워드) Unnatural Amino acid , Phosphate , Phosphate Binding Protein , CouA , FRET , Phosphate mop
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 이현수
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 화학과
- 실제 URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000066504
- UCI I804:11029-000000066504
- 본문언어 한국어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권 보호를 받습니다.
초록 (요약문)
단백질의 구조와 기능 연구는 생명체의 생화학적인 현상을 이해하기 위해 필수적이다. 기존 20개의 아미노산 외의 비천연 아미노산의 단백질로의 유전적인 도입은 단백질에 대한 더 많은 연구를 가능하게 하였다. 또한 단백질 내로의 형광체의 도입은 단백질의 구조나 물질의 정량적인 분석에 기여했다. 형광공명에너지전이 (FRET) 는 거리에 의존적인 특성을 가지고 있어 FRET 기반 센서는 다양한 생화학적인 분석에 이용되어 왔다. 하지만 기존의 형광단백질만을 사용한 FRET 기반 센서의 경우, 형광 단백질 자체로 인한 형광세기 감소와 제한적인 도입 위치 등의 문제를 가지고 있었다. 이에 따라 형광 비천연 아미노산을 센서 단백질에 도입하여 형광 세기와 제한적 위치의 한계점을 어느 정도 극복하였다. 본 논문에서는 형광 비천연 아미노산인 CouA과 형광단백질인 YFP를 FRET pair로 하여 phosphate 센서를 개발하였다. YFP를 결합단백질인 Phosphate Binding Protien (PBP)의 N-말단에 fusion 시키고 CouA을 PBP의 특정 위치에 도입하였다. CouA의 도입 위치는 Phosphate가 PBP에 결함함에 따라 발생하는 구조적인 변화로 YFP와 CouA 사이의 거리 차이가 가장 큰 곳으로 선택하였다. 센서 단백질의 Phosphate 결합에 따른 형광 측정 시, Phosphate contamination을 막기 위해 Phosphate mop을 사용하였다. Purine nucleoside phosphorylase (PNPase)와 7-methylquanosine (MEG)로 구성된 Phosphate mop (Pi mop)은 용액상의 free-phosphate를 제거하여 PBP에 결합된 phosphate를 제거하는 역할을 한다. 이와 같은 센서 단백질을 통하여 phosphate를 정량적으로 분석할 수 있을 것이다. 특히 phosphorylation 과 dephosphorylation 조절 메카니즘에서 중심적인 역할을 하는 phosphatase는 많은 생물학적인 현상에 기여하며, phosphate를 통해 그 과정들을 조절한다. 실제 Phosphatase는 tumor growth, 신경 발달과 인지, 그리고 당뇨병 등의 질병들과 관련되어 있으므로 정량적인 phosphate의 분석은 의미가 있을 것이다.
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