Development of a universal method for simultaneous analysis of 46 neurochemicals in the brain cell culture media, lysate and serum using LC-MS/MS
LC-MS/MS를 이용한 세포 배양액, 뇌조직 용해물과 혈청에서의 46 종 신경화학물질 동시분석법 개발
- 주제(키워드) neurochemicals , neurotransmitters , benzoyl chloride derivatization , method development , LC-MS/MS , cell culture supernatant , brain tissue lysate , serum , 신경화학물질 , 신경전달물질 , 벤조일클로라이드 유도체화 , 분석법 개발 , LC-MS/MS , 인간 태아 유래 신경전구세포 배양액 , 쥐 뇌조직용해물 , 쥐 혈청
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 오한빈
- 발행년도 2021
- 학위수여년월 2021. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 화학과
- UCI I804:11029-000000066187
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권보호를 받습니다.
초록/요약
In the present study, simultaneous analytical method for 46 species neurochemicals was developed, validated, and applied to various biological matrices from mice using UPLC-MS/MS. Since neurochemicals play important physiological roles in the brain and can serve roles in biomarkers, analytical research for accurate measurement in biological samples are required. Therefore, studies on developing the analytical method that encompasses various samples and improving the sensitivity of neurochemicals is necessary. Sample preparation for neurochemicals using benzoyl chloride reagent was introduced, and the pH of the reaction buffer, concentration of the benzoyl chloride solution, reaction temperature and time were optimized in the preparation. The pH of the derivatization environment obtained through the interaction of a combination of reaction buffer and concentration of reagent affects the derivatization efficiency was confirmed. Accordingly, pH 9.6 of reaction buffer and 0.5% benzoyl chloride were adopted because these conditions showed the highest sensitivity in the largest number of target compounds. Derivatization temperature and time for high sensitivity and the values were that 1℃ and 10 minutes, respectively. The developed method was validated for LOD, LOQ, linearity, precision, accuracy and matrix effects. Both LOD and LOQ were observed at the nM level, and the linearity was obtained with coefficients of determination above 0.988 for all target compounds. The intra and inter-day precision of the method were ranged from 9.6% to 24.0%. The accuracy was 85.0-114.6%. Matrix Effects were ranged from 18.8 -143.8%. Developed method was applied to cell culture supernatant from human, brain tissue lysate and serum from mice. This analytical research could be suitable for rapidly analyzing neurochemicals in various matrices and further helpful in neurochemical biomarkers analysis.
more초록/요약
본 연구에서는 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석기를 이용하여 신경전달물질, 신경조절물질 및 그 대사 산물을 포함한 46 종의 신경화학물질 동시분석법 개발을 위한 연구를 진행했다. 신경화학물질은 신체에서 중요한 생리학적 역할을 하고, 약물의 치료 효능을 모니터링하거나 뇌 질병의 진단을 위한 바이오마커 역할을 할 수 있기 때문에 생체 시료 내 신경화학물질의 정확한 측정을 위한 분석 연구가 필요로 된다. 이를 위해서 다양한 생체 시료를 아우르는 분석법의 개발과 그것의 감도 향상에 대한 연구가 필요하다. 신경화학물질의 분석 감도 향상을 위해 유도체화 과정에서 반응 용매의 pH, benzoyl chloride 용액의 농도, 유도체화 온도 및 시간 조건에서 최적화를 진행했다. 반응 용매의 pH와 benzoyl chloride 농도는 유도체화 반응 환경의 pH에 영향을 미치는 요인들이기 때문에 이차원 분석을 통하여 유도체화 효율을 조사했다. 결과적으로 반응 용매와 benzoyl chloride 농도의 조합을 통해 얻은 반응 환경의 pH가 신경 화학 물질의 민감도에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 가장 많은 수의 신경화학물질 종에서 가장 높은 감도를 보인pH 9.6의 반응 용액과 0.5% benzoyl chloride 용액을 최적화 조건으로 선정하였다. 또한 유도체화 온도와 시간은 각각 1℃ 와 10 분을 최적화 조건으로 선정했다. 개발된 유도체화 방법은 검출한계, 정량한계, 직선성, 정밀도, 정확도 및 매질 효과에 대해 유효성 평가를 위한 밸리데이션을 진행을 완료했다. 검출한계와 정량한계 모두 물질 별로 상이하지만 대체적으로 모든 물질에서 nM 수준의 감도를 확보했고, 모든 물질에서 검량곡선의 결정계수 0.988 이상의 좋은 직선성을 확보했다. Intraday, interday 정밀도는 모두 0.2%에서 15.4% 범위였고, 정확도는 85.0 - 114.6% 였다. 매질 효과 항목에서는 세포배양액과 RIPA buffer에 대해 평가를 진행했다. 개발된 동시분석법은 인간 태아 유래 신경전구세포 배양액과 쥐 유래 뇌 조직 용해물, 혈청에서 46종의 신경 화학 물질을 동시에 확인하는 데에 적용되었다. 본 연구는 다양한 매트릭스에서 신경화학물질 분석 연구와 질병 진단과 치료를 위한 신경화학마커 분석 연구에 도움이 될 것으로 기대된다.
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