Conversion of racemic unnatural amino acids to optically pure forms by a coupled enzymatic reaction
- 주제(키워드) Genetic code expansion , unnatural amino acids , D-amino acid oxidases , aminotransferases
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 이현수
- 발행년도 2021
- 학위수여년월 2021. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 화학과
- UCI I804:11029-000000065579
- 본문언어 한국어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권보호를 받습니다.
초록/요약
단백질 구조와 역할의 연구에서 다양한 종류의 화학적 작용기 (Chemically functional group)를 가진 비천연 아미노산 (Unnatural amino acid: UAA)들의 단백질 도입이 확대되고 있다. UAAs는 고효율로 단백질에 유전적으로 간단하게 도입된다. 이러한 유전적 도입방법은 Amber stop codon (TAG)과 이에 상응하는 tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair를 이용하여 목적 단백질에 도입한다. 하지만, UAAs는 비용면에서 비싸다는 단점이 있으며 구입하기 어려울 정도로 생화학적으로 관심이 큰 UAAs가 대부분이기 때문에 여러 복잡한 단계를 거쳐 합성을 해야 한다. 또한, UAAs가 도입된 단백질을 정제하기 위해서는 고농도의 UAAs가 필요하다. 라세믹 형태의 UAAs을 사용하면 단백질 발현 효율이 절반으로 감소하기 때문에 이러한 단점을 극복하기 위해서 광화학적으로 순수한 아미노산을 얻는 것이 중요하다. 비용면에서 강점을 갖기 위해서는 광화학적으로 순수한 UAAs를 공급하는 기술이 필요하다. 이전 연구에서는 합성하기 쉽고 이용하기 쉬운 α-keto acid에서 UAAs로 전환시켰다. 그래서 본 연구에서는 여러 단계의 합성 방법이 아닌 효소인 D-amino acid oxidase와 amino transferase의 생합성 반응을 통해 광화학적으로 순수한 L-form의 아미노산을 얻은 후 더 나아가 유전적 도입 방법을 통해 합성된 아미노산을 단백질에 도입하는 방법을 소개하려 한다.
more초록/요약
Genetic code expansion (GCE) technology is a useful tool for the site-specific modification of proteins. An unnatural amino acid (UAA) is one of the essential components of this technique, typically required at high concentration (1 mM or higher) in growth medium. The supply of UAAs is an important limitation to the application of GCE technology, as many UAAs are either expansive or commercially unavailable. In this study, two UAAs in a racemic mixture were converted into optically pure forms using two enzymes, the D-amino acid oxidase (RgDAAO) from Rhodotorula gracilis and the aminotransferase (TtAT) from Thermus thermophilus. In the coupled enzyme system, RgDAAO oxidizes the D-form of UAAs in a stereospecific manner and produces the corresponding α-keto acids, which are then converted into the L-form of UAAs by TtAT, resulting in the quantitative and stereospecific conversion of racemic UAAs to optically pure forms. The genetic incorporation of the optically pure UAAs into a target protein produced a better protein yield than the same experiments using the racemic mixtures of the UAAs. This method could not only be used for the preparation of optically pure UAAs from racemic mixtures, but the broad substrate specificity of both enzymes would allow for its expansion to structurally diverse UAAs.
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