FRET-based Histidine Sensors Using a Genetic Code Expansion Technique
- 주제(키워드) Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) , Histidine Binding Protein (HBP) , UAA (Unnatural Amino Acid) , Coumarin alanine (CouA)
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 이현수
- 발행년도 2020
- 학위수여년월 2020. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 화학과
- UCI I804:11029-000000065360
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권보호를 받습니다.
초록/요약
형광 단백질에 기초한 기존의 FRET 센서는 단백질-단백질 상호 작용 및 단백질 내의 구조적 변화를 조사하기 위한 강력한 도구였다. 그러나 그들은 크기가 크며 N- 또는 C- 말단에만 융합이 가능하다는 점에서 본질적인 한계를 지닌다. 따라서, FRET 기반 센서는 형광 비천연아미노산을 히스티딘 결합 단백질 (HisBP)에 도입하여 노랑 형광 단백질 (YFP)과 FRET fair를 형성함으로써 새로운 형태로 개발되었다. YFP를 HisBP의 N- 말단에 융합시키고, 형광 비천연아미노산의 일종인 Coumarin Alanine (couA)을 HisBP의 G119 부위에 도입시켰다. 최적화된 pH 및 염 농도 하에서, 최상의 센서 단백질은 L-His 결합 시 FRET 비에서 1.8 배 증가한 반면, 다른 19 개의 천연 아미노산을 사용한 경우에는 다소 미미한 변화를 보였다. FRET 센서를 위한 이 새로운 디자인 전략은 두 개의 형광 단백질을 사용하던 지금까지의 FRET 센서의 한계를 극복한다. 결과적으로, 이러한 전략은 단백질-단백질 상호 작용을 조사하고 단백질 형태의 변화를 조사하는데 유용하다. Fluorescence (or Forster) resonance energy transfer (FRET)는 형광 기반 응용 분야에서 널리 사용되어 왔다. FRET은 하나의 형광단의 방출 스펙트럼과 다른 형광단의 흡수 스펙트럼 사이에 상당한 중첩이 있고, 형광 단 사이의 거리가 전형적으로 10 nm 미만일 때 두 형광단 사이에서 발생한다. FRET 효율이 분리 거리의 거듭 제곱에 반비례한다는 점을 고려하면, 분자의 상호 작용 및 공간적 변화를 검출하는데에 적합하다. FRET 기반 센서는 다양한 색상의 형광 단백질의 발달에 따라 더욱 대중화되었으며, 재조합 형광 단백질 FRET 쌍은 서로 독립적으로 표현되거나 융합된 형태일 수 있다. 이러한 FRET 쌍은 다양한 생체 분자 및 이온을 감지하고 효소 활성을 측정하는 데에 사용되어 왔다. 형광 단백질을 기반으로 한 다양한 FRET 센서가 개발되어 다양한 응용 분야에 성공적으로 적용되었지만, 이는 두 개의 단백질이 fusion되는 만큼 크기가 커진다는 점, 그리고 형광단백질은 N- 또는 C- 말단에만 fusion이 가능하다는 점과 같은 본질적인 한계를 가지게 된다. 반면 fluorescent UAA의 genetic incorporation은 위치에 구애받지 않고 단백질의 어느 site에나 도입이 가능하며, 단일 아미노산 돌연변이 유발에 의해 달성될 수 있기에 기존 단백질에 대한 영향을 최소화할 수 있다는 점에서 FRET 기반 생화학적 연구에 대해 중대한 이점을 가진다. 이렇게 개발된 FRET 센서는 단백질에 형광 아미노산을 도입하고 그 단백질에 노랑 형광 단백질 (YFP)을 fusion하여 FRET 쌍을 형성함으로써 개발되었으며, L-His가 높은 sensitivity 및 selectivity로 검출될 수 있음이 입증되었다.
more초록/요약
Conventional FRET sensors based on fluorescent proteins had been a powerful tool for investigating protein-protein interactions and structural changes within proteins. However, they have inherent limitations in that they are large and can only be fused at the N- or C-terminus. Therefore, the FRET-based sensor was developed in a new form by introducing a fluorescent unnatural amino acid into histidine binding protein (HBP) to form a FRET fair with the yellow fluorescent protein (YFP). YFP was fused to the N-terminus of HBP and Coumarin Alanine (CouA), a type of fluorescent unnatural amino acid, was introduced into the G119 site of HBP. The sensor protein increased 1.8 times in the FRET ratio upon L-His binding, while the other 19 natural amino acids showed a slight change. This design strategy for the FRET sensor overcomes the limitations of the FRET sensor to date, which used two fluorescent proteins. Consequently, this strategy is useful to investigate interactions between proteins and to investigate changes in protein morphology. Fluorescence (or Forster) resonance energy transfer (FRET) has been widely used in fluorescence-based applications. FRET occurs when there is a significant overlap between the emission spectrum of one fluorophore and the absorption spectrum of the other and the distance between the fluorophores is less than 10 nm. Considering that the FRET efficiency is inversely proportional to the power of the distance, it is suitable for detecting molecular interactions and conformational changes. FRET-based sensor has become more popular with the development of fluorescent proteins of various colors, and FRET pairs of recombinant fluorescent proteins may be expressed independently of each other or infused form. These FRET pair has been used to detect various biomolecules and ions and measure enzyme activity. Various FRET sensors based on fluorescent proteins have been developed and successfully applied to various applications but have the inherent limitations that the size of the fluorescent proteins is relatively large as two proteins are the proteins can be fused only at the N- or C-terminus. On the other hand, the genetic incorporation of fluorescent UAA has the significant advantage that it can be introduced at any site of the protein regardless of its location and can minimize the effect on existing proteins since it is made by single amino acid mutagenesis. This FRET sensor was developed by introducing a fluorescent amino acid to a protein and fusion of a yellow fluorescent protein (YFP) to the protein to form a FRET pair, and it was proved that L-His can be detected with considerable sensitivity and selectivity.
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