Protein modification using genetic code expansion technology and Its applications
유전코드확장기술을 통한 단백질 변형과 적용: 인공 단백질 복합체 개발 기술의 확장
- 주제(키워드) Unnatural amino acids , Protein modification , Bio-orthogonal reaction , protein assembly , 비천연아미노산 , 단백질 변형 , 생물직교반응 , 단백질 조립체 , 단백질 복합체
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 이현수
- 발행년도 2020
- 학위수여년월 2020. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 화학과
- UCI I804:11029-000000065278
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권보호를 받습니다.
초록/요약
Proteins are essential biomolecules involved in complex biological processes, and studying the structure and function of proteins is of great importance. Due to simple and limited functional groups in wildtype proteins, methods for protein modification have been developed to study and engineer the function and structure of proteins. Many methods are available for protein modification which include chemical methods using lysine and cysteine as reactive functional groups, protein ligation and enzymatic protein labeling. Although they are useful in specific applications, these methods have limitations for general biochemical applications due to low efficiency and selectivity and/or technical complexity. To overcome these limitations, unnatural amino acids with bio-orthogonal functional groups have been genetically incorporated into proteins. An important advantage of the method is that it allows us to modify proteins site-specifically and quantitatively. In this thesis, genetic code expansion technology is applied to site-specifically introduce chemical handles into target proteins, and the proteins with the chemical handle are used for introduction of chemical probes, protein-protein conjugation, and protein assembly. First, site-specific protein-protein conjugation was performed by genetically incorporating an azide-containing amino acid into one protein and a bicyclononyne (BCN)-containing amino acid into the other. Three to four sites in each of the proteins were tested for conjugation efficiency, and three combinations showed excellent conjugation efficiency. The conjugation reaction can be conducted by simple mixing and does not require additional reagents or linker molecules. Therefore, this method would be very useful to form protein-protein conjugates and protein complexes. Second, a metal-chelating amino acid was site-specifically incorporated into a monomeric protein by using a genetic code expansion technique. Based on the crystal structure of the protein, a few sites were selected and each mutant protein was tested for dimerization mediated by metal ions. When the metal-chelating amino acid was introduced into multiple sites of the protein, the monomeric protein was assembled to form oligomers. This oligomerization can be modulated in a predictable way by controlling the number and location of the unnatural amino acid and metal species. This method would be useful to rationally design protein assembly for diverse proteins. Third, based on the two studies above, protein complexes were formed by strong noncovalent interaction. Cucurbituril-7 (CB[7]) and adamantanylamine are known to have a dissociation constant (Kd) of 10-14. We introduce CB[7] and an admantanylamine into proteins by using a genetic code expansion technique and a copper-catalyzed azide–alkyne cycloaddition (CuAAC) reaction. Quantitatively conjugated proteins with CB[7] or an admantanylamine were obtained and applied to protein dimerization by the interaction between the high affinity binding partners. This is the first site-specific and homogeneous conjugation of proteins with CB[7] and would be useful for various biochemical applications including biosensors and enzyme complexes Finally, L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) was biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase (TPL) from catechol, pyruvate, and ammonia, and the biosynthesized amino acid was directly incorporated into proteins. The aaRS used in the present study had better efficiency than that of a previously reported aaRS. This direct incorporation system efficiently incorporated DOPA, with no incorporation of Tyr, and with better protein yield than the previous genetic incorporation system for DOPA. Three biochemical experiments with mutant proteins containing DOPA confirmed the genetic incorporation of biosynthesized DOPA and revealed its potential for various biochemical applications. The genetic code expansion technique described in the study have made it possible to site-specifically introduce chemical handles for quantitative modification of target proteins. The chemical handles including azides and alkynes can be used for bioorthogonal reactions that are not disturbed by functional groups in natural biomolecules. Mutant proteins with biochemical probes, metal chelators, and strong binding groups have great potential for various biochemical applications. Future studies will include applications of the methods described above into protein self-assembly with complex structures and development of biosensors.
more초록/요약
단백질의 화학적 변형을 통해서 흥미로운 성질의 화학 작용기들을 효율적으로 단백질에 도입하는 연구는 단백질의 구조와 기능을 밝히고, 더 나아가 새로운 기능을 갖는 단백질도 생성할 수 있다는 점에서 화학생물학의 매우 중요한 분야라고 할 수 있다. 현재까지 개발된 방법에는 단백질의 N-말단, C-말단, 라이신, 시스테인 및 효소 반응 등을 이용한 기술들이 있다. 하지만 이러한 기술들은 위치 특이성과 반응의 효율에 문제점을 가지고 있어서 그 응용범위가 제한된다. 이러한 측면에서 본 학위 논문에서는 다양한 비천연 아미노산을 표적 단백질에 위치 특이적으로 도입하여 이를 단백질 표지 및 복합체 형성 등에 적용하였다. 먼저, 직접적 화학 반응을 통한 단백질 이량체를 형성하였다. 금속 촉매 없이 고리화 첨가 반응 (SPAAC)을 통한 선택적, 효과적 공유결합 형성이 가능한 두 종류의 짝 (pair)이 되는 비천연 아미노산 (BCN-K, Azido-F)을 서로 다른 두 개의 표적 단백질에 도입하였다. 이후 효율적 공유결합을 위한 입체 장애 최소화 위치의 선택 및 적용을 통해 정량적으로 이량체를 형성하였다. 다음으로, 금속을 매개로 한 단백질 복합체를 형성하였다. 이는 가역적 성질을 갖고, 공유결합에 비해 빠른 결합 속도의 장점을 가지고 있어 단백질 복합체를 형성하는데 용이하다. 금속 결합력을 갖는 비천연 아미노산 (Bpy-A)을 표적 단백질의 선택된 위치에 도입하고 다양한 금속이온에 대한 결합력을 분석하였다. 그 결과, 금속의 종류에 따라 예측 가능한 형태로 단백질 복합체를 형성함을 알 수 있었다. 더 나아가 위의 두 연구를 기반으로 강한 분자간 상호작용을 통한 단백질 복합체를 형성하였다. 쿠커비트릴-7과 아드만틸아민은 약 10-14 정도의 해리 상수를 가지는 것으로 알려져 있다. 이에 구리 이온을 촉매로 고리화 첨가 반응 (CUAAC)을 통해 선택적으로 공유 결합이 가능한 비천연 아미노산 (Azido-K)을 형광 단백질의 특정 위치에 도입하였다. 그리고 고리화 첨가 반응의 짝 (pair)이 되는 작용기 (Alkyne)를 포함하는 쿠커비트릴-7과 아드만틸아민을 반응시켜 형광 단백질에 결합시켰다. 이렇게 도입된 두 결합 짝을 이용하여 두 형광단백질의 이합체를 형성하고 이것을 형광공명에너지 전이 등의 분석을 통해 확인하였다. 이는 단백질 복합체를 형성하는데 있어서 한계였던 결합속도와 결합력을 극복했다는데 의의가 있다. 마지막으로 다양한 생화학적 기능을 포함하는 비천연 아미노산 (L-DOPA)를 세포 내에서 생합성하여 도입할 수 있는 시스템을 구축하였다. 이를 통해 퀴논 고리화 첨가 반응 (SPOCQ)을 통한 정량적 형광 표지 및 상호작용하는 두 단백질 간의 가교 결합을 형성하였으며 아민-카테콜 반응을 통해 단백질 간 공유결합을 형성할 수 있었다. 이러한 실험 결과들을 바탕으로 본 연구에서는 기존의 보고된 화학적 변형 기술보다 정교하며 기술적으로 간단한 화학적 변형 기술들을 개발 및 적용하였다. 유전 코드 확장 기술에 기반한 이러한 전략은 기존의 화학적 변형 기술이 가지는 근본적인 한계를 극복하고 바이오 이미징 및 단백질 기능 분석, 단백질 기반 바이오 센서 개발, 바이오 소재, 바이오 촉매 및 새로운 단백질 기반의 의약품 제조 등 다양한 바이오 플랫폼에 적용 가능할 것으로 기대된다.
more