검색 상세

DNA memory, DNA Looping, and Phage DNA Ejection

DNA 메모리, DNA 고리화 및 phage DNA 방출

초록/요약

Single-molecule observation of DNA molecules has attracted enormous attention because visualization of single DNA molecules enables to investigate DNA-related cellular events, such as DNA transcription, replication, recombination, repair, and organization. In order to observe the DNA molecules with fluorescent microscopy, staining materials such as organic dyes and DNA-binding fluorescent proteins are necessary because the DNA molecules are spectroscopically silent. One of the recent hot issues is the visualization of DNA molecules with FP-DBPs for studies of chromosome dynamics, DNA replication, DNA transcription factors, DNA repair and damage; therefore, the thesis discussed FP-DBP’s characteristics and applications. FP-DBPs and organic dyes enable to stain DNA molecules with specific patterns. The first application of single-molecule DNA observation of staining patterns introduced in this thesis is the directionality analysis of λ phage DNA ejection. In order to investigate the directionality, sequence-specific staining of λ phage DNA using silicon rhodamine-polypyrrole and combination of netropsin and YOYO enables the single-molecule observation of staining patterns on ejected λ phage DNA that reveals which end of λ phage DNA is ejected first. It is a new single-molecule DNA observation-based approach to investigate the directionality of phage DNA ejection. Single-molecule DNA observation of staining patterns also allows detection of the DNA looping that involves DNA transcription, replication, and recombination. In this method, the difference of the DNA concentrations at DNA looping sites and DNA backbones results in different fluorescence intensity at corresponding sites; therefore, it is possible to detect DNA looping sites on DNA backbones. The novel method used for the analysis of DNA looping by ToxR-RNA polymerase complexes and LacI tetramers has great potential to accurately detect DNA looping sites and perform quantitative analysis of DNA looping. Another example of single-molecule DNA observation of staining patterns is digital information storage in DNA sequences. In this study, TAMRA-polypyrrole, a staining dye specifically binding to AT-rich DNA sequences, enables to generate sequence-specific patterns. With TAMRA-polypyrrole, it is possible to observe specific staining patterns on single DNA molecules by visualization of DNA fragments synthesized by connecting AT-rich fragments and CG-rich fragments. In our digital information storage system, AT-rich fragments represent “1”, and CG-rich fragment represent “0”. With a simple ligation method, the short digital information, “1010101010…”, was stored in DNA fragments. Lastly, not only by fluorescence microscopy, but electron microscopy is also capable of visualizing DNA molecules via DNA metallization. For DNA metallization, DNA binding peptides with an SH- group at the end bind to DNA molecules and Au nanoparticles, thereby assembling Au nanoparticles along the DNA backbones followed by DNA metallization by growing the Au nanoparticle seeds in HAuCl4. With this method, single-molecule DNA observation is possible at nanometer scales.

more

초록/요약

DNA 단일분자 관찰은 많은 관심을 받고 있는데 그 이유는 단일 DNA 분자를 관찰함으로써 세포의 DNA 관련 현상들인 DNA 전사, 복제, 재조합, 수리 및 조직 등을 연구할 수 있기 때문이다. DNA 분자들을 관찰하기 위하여 유기염료나 DNA결합 형광단백질과 같은 DNA 염색물질이 필요한데 이는 DNA분자들이 형광 현미경에서 직접 관찰되지 않기 때문이다. 최근의 화제가 되고 있는 이슈들 중의 하나가 FP-DBP로서 세포내에서 발현하여 choromosome dynamics, DNA replication, DNA transcription factors, DNA damage and repair에 대하여 연구하고 있다. 그래서 최근까지의 FP-DBP를 사용하여 DNA를 염색하고 분석한 응용에 관한 예를 정리하였다. FP-DBP와 organic dye들로 DNA에 염색패턴을 만들어서 관찰하는 실험들이 활발하게 진행되고 있다. 첫 단일분자 DNA 패턴 관찰 응용의 예로 λ파지 DNA 방출에 대한 방향성 분석을 선택하였다. λ파지 DNA 방출 방향성을 연구하기 위하여 서열 특이적으로 λ 파지 DNA를 염색하여서 염색패턴을 관찰할 수 있는 silicon rhodamine-polypyrrole 또는 netropsin과 YOYO를 조합하여 사용하는 방법을 사용하여서 DNA를 단일분자 수준에서 관찰하였다. 이 것은 단일 분자 DNA 관찰에 기반한 새로운 방법으로써 파지 DNA방출 방향성을 연구할 수 있다. 그리고 단일분자 DNA 패턴 관찰을 통하여 DNA 전사, 복제 및 재조합에 관여하는 DNA loop을 관찰하였다. 이 방법에서는 DNA looping site들과 DNA backbone에서의 DNA농도는 다르며 그 차이는 해당 위치의 형광세기 다름을 만들어낸다. 그러므로 DNA backbone에서 DNA looping site들을 관찰할 수 있다. 이 새로운 방법은 ToxR-RNA복합체나 LacI tetramer에 의한 DNA looping을 분석함으로써 DNA looping site들을 관측하고 DNA looping을 정량할 수 있는 잠재력을 가졌다. 다른 단일분자 DNA 패턴 관찰의 예는 DNA서열에 디지털 정보를 저장하는 것이다. 이 방법에서 AT-rich DNA 서열들을 특이적으로 염색할 수 있는 TAMRA-polypyrrole이 서열 특이적인 패턴을 만드는데 사용된다. 그러므로 TAMRA-polypyrrole로 AT-rich단편들과 CG-rich 단편들을 연결하여서 합성한 DNA 단편을 시각화함으로써 단일 분자 DNA의 특이적인 염색 패턴을 관찰할 수 있다. 그리고 이 연구에서 사용한 디지털 정보 저장 시스템에서는 AT-rich 단편은 1 그리고 CG-rich 단편은 0으로 간주한다. 간단한 ligation 방법으로 짧은 디지털 정보인 10101010…을 DNA단편에 정장하였다. 마지막으로 단일 분자 DNA관찰은 형광현미경 뿐만아니라 전자현미경으로도 관찰이 가능한데 DNA metalization이 필요하다. DNA metallization을 하기 위하여SH기가 붙은 DNA 결합 peptide들을 사용하여 DNA와 Au nanoparticle들에 결합시킴으로써 Au nanoparticle들을 DNA backbone들을 따라 결합시킨다. 그리고 이러한 Au nanoparticle들을 seed들로 사용하여서 HAuCl4용액과 환원제 속에서 키움으로써 DNA mallization을 이룰 수 있다. 이 방법으로 단일분자 DNA를 나노미터 수준에서 관찰할 수 있다.

more