고해상도 이미지를 위한 유전자 결합 형광단백질 개발과 특성조사 및 최적화
Characterization and Optimization of DNA Binding Fluorescent Protein for Acquisition of High SNR Fluorescent Microscope Images
- 주제(키워드) Optical Mapping , DNA binding peptide
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 조규봉
- 발행년도 2020
- 학위수여년월 2020. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 화학과
- UCI I804:11029-000000064757
- 본문언어 한국어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권보호를 받습니다.
초록/요약
Optical Mapping Sequencing (OM) can analyze individual strands of long single DNA in the fluorescent microscope using dyes which can even reveal specific genetic patterns characteristic of sequence specificity with robust information. Epigenetic properties marked by high frequency of chromosomal variations which NGS (Next Generation Sequencing) cannot analyze with the dependency on massive parallel short-read DNA sequencing technology can be studied via OM. In previous studies, single DNA molecules dyed with a variety of DNA Binding Protein Fluorescent Protein (FP-DBP) showed that the signal-to-Noise Ratio (SNR), the quantitative indicator of image quality, is proportional to kd of DNA binding motif used for FP-DBP. Therefore, 2HMG or two High Mobility Group (HMG), which ranked the highest next to YOYO-1 in terms of SNR, become a candidate for enhancing SNR by changing FPs. The limitation of FP-DBPs occurs in the analysis of larger DNA molecules due to non-specific interactions inherent of proteins which participate in binding other than target DNAs leading to the significant increase of background noises. Yet, since intercalating dyes destabilizes the double helix structure, a small DNA binding peptide HMG thought to be of less non-specific binding than larger tTALE was fused with FPs using a flexible linker. In addition, based on the epigenetic-genetic hybrid label position in DNA image, I attempted to match fragmented images to the reference using Python programming.
more초록/요약
DNA 단일분자를 분석하는 광학서열분석법은 염색된 긴 DNA 분자를 형광 현미경으로 관찰하고 서열 특이성을 가지는 염색으로 가시화되는 DNA 염기서열 패턴으로 다양한 유전적 특징을 직관적으로 분석할 수 있다. 이 방법은 후생유전적 성질인 Chromosomal Variation이 잦은 염기서열 구간을 차세대 서열분석법이 지향하는 Short-read가 가지는 한계를 극복할 수 있다. 이전 연구에서 유전자결합 형광단백질(FP-DBP)로 염색된 DNA의 Signal-to-Noise Ratio (SNR)가 각 단백질 염료가 가지는 DNA 결합체의 Kd 값과 정비례한 관계가 있음이 밝혀졌다. SNR은 화질을 정량적으로 측정가능한 잣대인데 High Mobility Group (HMG)가 형광단백질의 양극단에 유연한 linker로 연결된 2HMG-eGFP가 합성염료인 YOYO-1 다음으로 가장 높은 SNR을 기록했다. FP-DBP가 DNA 이외의 곳에 불특정 하게 결합으로 배경잡음이 늘어나서 분석하는 긴 DNA를 분석하는 데 한계가 있다. 반면에 합성염료는 DNA의 이중나선 구조를 변형시키므로 단백질 염료가 선호되었다. 따라서 tTALE이나 HNS 같이 분자량이 큰 대사단백질에 비해 작은 펩타이드이면서 높은 SNR을 가지는 HMG를 사용하여 여러 형광단백질이 달린 FP-DBP를 개발했다. 추가적으로 Epigenetic-Genetic Hybrid Labelling이 된 긴 DNA를 분석하고 특정 Label 위치를 통해서 Image Matching을 하여서 서열분석을 가능케하는 프로토타입을 Python으로 구현해보았다.
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