Engineering periplasmic binding proteins for amino acid sensors with improved binding properties
- 주제(키워드) amino acid sensor , unnatural fluorescent amino acid , periplasmic binding protein , protein engineering
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 이현수
- 발행년도 2018
- 학위수여년월 2018. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 화학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000063331
- UCI I804:11029-000000063331
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권보호를 받습니다.
초록/요약
단백질의 구조와 기능 연구는 화학적 또는 생물학적 자연 현상을 이해하기 위해서 아주 중요하다. 단백질 내 형광체 도입은 생체 내/외적으로 단백질 구조, 기능 및 동역학 연구 등을 위한 좋은 분석법을 제공할 수 있다. 특히 형광공명에너지전이 (FRET) 기반 센서는 분자의 구조적 변화에 민감하기 때문에 다양한 생화학적 분석에 사용된다. FRET 기반 센서는 다양한 방법들에 의해 디자인될 수 있지만, 형광체의 화학적 결합 과정에서의 수율이나 선택성 또는 제한적 위치와 같은 한계점들을 지니고 있다. 이러한 기존 센서의 단점을 극복하기 위한 방법 중 하나는 형광 아미노산을 센서 단백질에 도입하는 것이다. 지금까지 유전적 도입 방법을 통해 몇몇의 형광 아미노산이 단백질 내로 도입되었고, 이러한 형광 아미노산과 FRET 짝 (pair)으로 형광 단백질을 이용하여 센서를 디자인한다면 기존 센서의 한계점들을 어느 정도 극복할 수 있다. 본 논문에서는 비천연 형광 아미노산을 형광 단백질 (FP)과 융합된 세포질 결합 단백질 (PBP)에 도입하여 FRET 기반 센서를 개발하였다. 글루타민 센서를 개발하기 위해 글루타민 결합 단백질의 N-말단에 초록 형광 단백질 (GFP)을 융합하였고, 138번 위치에 쿠마린 형광 그룹을 가진 비천연 아미노산 (CouA)을 도입하였다. 센서 단백질은 링커 길이 및 분석 조건을 최적화하여 L형 글루타민 결합에 따라 최대 1.9배의 FRET 비율 증가를 보였으며, D형 이성질체와 나머지 천연 아미노산들에 대해서는 반응성을 가지지 않는 것을 확인하였다. 이러한 센서 디자인이 다른 세포질 결합 단백질에도 적용 가능한지 확인하기 위해, 우리는 루신 결합 단백질을 이용하여 루신 센서를 디자인하였다. 글루타민 센서와는 달리 노랑 형광 단백질 (YFP)이 추가적으로 형광공명에너지전이 받개로 사용되었으며, 루신 결합 단백질 178번 위치에 비천연 형광 아미노산이 도입되었을 때 최대 2.5배의 FRET 비율 증가를 가지는 루신 센서를 개발할 수 있었다. 또한 센서 단백질을 엔지니어링하여 L형 루신에 대한 결합 특이성 또는 결합력을 증가시킬 수 있었으며, L형 루신 뿐만 아니라 L형 메티오닌에 대해서도 반응성을 이끌어낼 수 있었다. 이렇게 개발된 일부의 센서들을 이용하여, 생체 시료 내의 아미노산 농도 또는 특정 아미노산 혼합물의 광학 순도를 성공적으로 측정할 수 있었다. 확장된 유전적 코드를 가지게끔 유기체를 조작 및 개발하는 일은 비천연 아미노산 도입을 위한 생화학적 분야에 있어 중요한 사안이다. 만약 비천연 아미노산의 흡수를 매개하는 운송 시스템을 가지는 유기체를 개발한다면, 비천연 아미노산을 단백질에 기존 보다 효율적으로 도입할 수 있을 것이다. 우리는 앞선 연구에서 센서 단백질이 리간드와의 반응시 FRET 변화가 일어난다는 점을 이용하여, 루신 결합 단백질을 비천연 아미노산에 대하여 반응성을 가지게끔 엔지니어링하였다. 또한 세포 내에서 엔지니어링한 루신 결합 단백질이 표적 단백질과 함께 발현될 때 더 효율적으로 비천연 아미노산이 도입되는 결과를 통해, 우리는 비천연 아미노산에 대하여 반응성을 가지는 루신 결합 단백질이 세포 내에서 비천연 아미노산을 효율적으로 흡수함을 간접적으로 확인할 수 있었다. 결과적으로, 이러한 FRET 기반의 센서 디자인 전략은 생화학적으로 흥미로운 분자들을 감지할 수 있는 센서 단백질을 설계하거나 엔지니어링을 통해 수용체 본연의 특성을 확장시킬 수 있는 유용한 방법이 될 수 있을 것으로 기대된다.
more초록/요약
To understand chemistry and biology in life, studying protein structure and function is critical. Protein modification with a fluorescent probe provides a powerful tool to study protein structure, function, and dynamics either in vitro or in vivo. Especially, fluorescence (or Förster) resonance energy transfer (FRET) sensor that is sensitive to molecular conformational change has been widely used for various biochemical applications. FRET sensors would be designed by various strategies; however, they have their own limitations, including conjugation yield, selectivity, and restricted location. One method to develop a FRET sensor is to introduce a fluorescent amino acid into FRET sensor. Over the last decade, several fluorescent amino acids have been genetically incorporated into proteins, and the design strategy for FRET sensor containing a fluorescent amino acid and partner FP would overcome the limitations of current FRET sensors. In this study, a FRET-based sensor was developed by incorporating a fluorescent unnatural amino acid into periplasmic binding protein (PBP), which formed a FRET pair with fluorescent protein (FP). To develop a L-Gln sensor, GFP was fused to the N-terminus of GlnBP, and the fluorescent unnatural amino acid, L-(7-hydroxycoumarin-4-yl)ethylglycine (CouA), was incorporated into the site for N138 in GlnBP. FRET sensors were tested that contained linkers of different length between GFP and GlnBP, and assay conditions were optimized by changing the pH and salt concentration of the assay buffer. Under optimal conditions, the best sensor protein produced a 1.9-fold increase in the FRET ratio upon L-Gln binding, whereas either no change or minimal change was seen using other amino acids, including the other 19 natural amino acids and D-Gln. To confirm that this novel design strategy could be applied to other PBPs, we engineered a leucine-binding protein (LBP) to design an L-Leu sensor. CouA was genetically incorporated into the protein as a FRET donor, and a yellow fluorescent protein (YFP) was fused with its N-terminus as a FRET acceptor. When CouA was incorporated into position 178, the sensor protein showed a 2.5-fold increase in the FRET ratio. Protein engineering significantly improved its substrate specificity, showing minimal changes in the FRET ratio with the other 19 natural amino acids and D-Leu. Further modification increased the sensitivity of the sensor protein (14-fold) towards L-Leu, and it recognized L-Met as well with moderate binding affinity. Selected mutant sensors were successfully used to measure concentrations of L-Leu in a biological sample (fetal bovine serum) and to determine the optical purity of Leu and Met. Construction of an engineered organism with an expanded genetic code has been an important issue in chemical biology and there has been a lot of progress in the development of the unnatural organism for genetic incorporation of UAAs. For efficient biosynthesis of the mutant proteins containing UAAs, it is desirable to construct an unnatural organism with a specific transport system for mediating uptake of UAAs. Using FRET-based sensor design strategy, LBP was engineered to recognize various UAAs. We confirmed that UAAs were incorporated into proteins efficiently when an engineered LBP was co-expressed with target protein in Escherichia coli (E. coli), BL21 (DE3) and B-95. ΔA. Consequently, our FRET-based sensor design strategy is very helpful in designing protein sensors for biochemically interesting molecules and enables engineering the receptors to expand their properties.
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