톱-다운 질량분석법을 이용한 생체시료내의 저분자량 단백체 분석
Comprehensive analysis of low molecular weight proteome in biological samples using top-down mass spectrometry
- 주제(키워드) 단백체 , 질량분석 , 톱-다운 , Post-translational modification , single amino acid variation
- 발행기관 서강대학교 대학원 융합의생명공학과
- 지도교수 조규봉
- 발행년도 2018
- 학위수여년월 2018. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 융합의생명공학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000063229
- UCI I804:11029-000000063229
- 본문언어 한국어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권보호를 받습니다.
초록/요약
질량분석기를 이용하여 단백질을 분석하는 방법 중의 하나인 톱-다운 분석법은, 단백질을 트립신과 같은 단백질 분해 효소로 절단하지 않은 상태로 질량분석기에 도입하여 온전한 상태의 proteoform을 분석할 수 있는 방법이다. 따라서 alternative splicing, post-translational modifications (PTMs), single amino acid variations (SAAVs), proteolysis 등으로 인한 full sequence 의 정보를 얻을 수 있다. 본 연구에서는 단백질들을 질량분석기로 분석하기 전에 complexity를 줄여주기 위해 tube gel을 이용하여 분자량에 따라 단백질을 분리해 주는 gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (GELFrEE) 방법을 사용하여 fraction을 나누었고, 30 kDa 이하의 단백질들을 고분해능의 질량분석기에 도입하여, high resolution MS 데이터와 MS/MS 데이터를 얻은 후에 ProsightPC 3.0 서치프로그램을 이용하여 단백질들을 분석하였다. 챕터 1 에서는 human plasma 시료를 이용하여 혈액속의 abundance 단백질을 제거해 가며 저분자량의 단백질들을 프로파일링 하였으며, 대장암과 대조군의 plasma를 비교분석하여 차등발현이 나는 단백질에 대해서는 western blot 실험으로 검증하였다. 챕터 2 에서는 정상 조직과 대장암 조직에서 단백질을 추출 후 저분자량의 단백질을 비교분석 하였다, 그 결과 대장암 특이적인 proteoform들에 대해서 relative abundance의 변화를 질량분석 결과에서 확인할 수 있었으며, 대장암 조직에서 특이적으로 동정된 cleaved product의 site 들도 확인 하였다. 챕터 3 에서는 위암 4기의 조직시료에서 림프절 전이가 없는 시료와, 림프절 전이가 있는 시료의 저분자량의 단백질을 비교 분석하여, 림프절 전이에 특이적인 proteoform들을 동정하였다. 결론으로, 이 논문에서는 톱-다운 방식의 질량분석 방법을 이용하여 다양한 생체시료내의 저분자량의 단백체를 분석하였다. 동정된 proteoform들 중에는 intact 단백질들과 단백질들의 cleaved product 들이 있으며, 다양한 PTMs 와 SAAVs를 보유한 proteoform들도 동정할 수 있었다. 이러한 톱-다운 방식의 분석 플랫폼을 활용하여 앞으로 질병군에서의 차이가 나거나, PTMs, SAAVs 의 변화를 보이는 바이오마커 후보군을 발굴하는 데에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
more초록/요약
Top-down mass spectrometric analysis is a method of analyzing intact proteins by introducing them into a mass spectrometer without protease such as trypsin, and thus enables a full characterization of the various protein proteoforms due to alternative splicing, post-translational modifications (PTMs), single amino acid variations (SAAVs) and proteolysis. In this study, proteins were separated by gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis GELFrEE), in which proteins are constantly eluted from a sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) tube gel column based on MW and collected in liquid form, resulting in predictable size separation with high resolution and reproducibility. Then, the GELFrEE fractions containing up to 30 kDa were subjected to high-resolution mass spectrometer, and the high-reslution MS and MS/MS data were processed using ProSightPC 3.0. In Chapter 1, low molecular weight proteins containing up to 30 kDa present in human plasma samples from without immunoaffinity depletion and depletion of the top two, six, seven high-abundance proteins were analyzed using top-down mass spectrometry. Furthermore, additional comparative analysis of plasma samples without removal of high-abundance proteins between healthy controls and colorectal cancer (CRC) patients were pursued using top-down approach. In Chapter 2, we obtained proteins from normal and CRC tissues, respectively, and analyzed the low molecular weight proteins (<30 kDa) using top-down mass spectrometry. As a result, we were able to detect proteoforms including a variety of cleaved products specific to CRC tissues. In Chapter 3, we analyzed low molecular weight proteins (<30 kDa) in gastric cancer tissues (stage 4) with different extent of lymph node metastasis using top-down mass spectrometry, and identified and characterized proteoforms of which relative abundances are changed. In conclusion, we analyzed the low molecular weight proteoforms in various biological samples using top-down mass spectrometry. The identified proteoforms were cleaved products of proteins as well as intact proteins, and were able to identified proteoforms with various PTMs and SAAVs. We believe that the current top-down analytical platform can be used discover candidate biomarkers that show differential abundance levels or undergo PTMs and SAAVs in various disease states.
more