서강대학교

초록/요약

최근 자연계에 존재하지 않는 다양한 비천연 아미노산들에 대해 높은 기질 수용성을 보이는 Methanocaldococcus jannaschii p-cyanophenylalanine aminoacyl-tRNA synthetase (pCNFRS)를 이용하여 세포 안에서 D-아미노산들의 단백질 내 도입 가능성을 확인한 연구가 보고되었다. 그 결과, D-Glutamic acid를 제외한 18개의 D-아미노산들 중 8개의 D-아미노산들이 단백질 내 높은 도입 효율을 보이는 것으로 확인 되었다. 본 논문에서는 최근 보고된 이러한 연구 결과를 토대로, 단백질 내 도입효율이 높다고 보고된 8개의 D-아미노산들을 emerald green fluorescent protein (emerald GFP)의 90번 자리에 도입해 봄으로써 그 도입 효율을 분석하는 연구를 다시 한 번 재현해 보았다. 그러나 그 결과, 기존에 보고된 결과와는 다르게 D-Phe이 8개의 D-아미노산 중 가장 높은 효율로 도입되었으며 나머지 D-아미노산들 또한 다른 결과 값을 가지는 것을 확인 하였다. 그리고 MALDI-TOF mass spectrometry를 이용한 질량 분석을 통해, 도입된 아미노산들이 D-아미노산이 아닌 기존에 Escherichia coli 세포 내부에 존재하는 L form의 Phenylalanine인 것을 확인하였다. 이로써 D form의 Phenylalanine이 E.coli 세포 내부에 존재하는 aminotransferase에 의해 L form의 phenylalanine으로 변형되어 단백질로 도입되었을 가능성을 제시하였고, 나머지 7개 D-아미노산 또한 도입되지 않았다는 것을 설명하며 결론적으로 8개 D-아미노산이 높은 효율로 도입되었다는 기존 연구 결과를 반박하였다. 또한 다양한 기질 수용성을 보이는 Methanosarcina mazei pyrrolysyl-tRNA synthetase mutant (PylRS_384W)를 이용하여 D form의 라이신 유도체인 N(epsilon)-tert-butoxy carbonyl-D-lysine (D-Boc-lysine)를 emerald GFP의 39번과 90번 자리에 각각 도입해봄으로써 그 효율을 L form과 비교하였으며 그 결과 D form의 Boc-lysine이 높은 효율로 도입됨을 확인 하였다. 본 연구는 더 나아가 앞서 언급한 결과들을 바탕으로, D-Phe과 D-Boc-Lys의 도입을 확인 및 증명하기 위하여 maltose binding protein (MBP)에 이 두 D-아미노산들을 각각 도입하여 단백질의 crystal structure까지 분석해 보고자 한다. 본 연구는 Escherichia coli에서 D-아미노산들의 도입 가능성과 효율에 대하여 기존에 보고된 결과를 반박하고 다시 재해석 하였으며, 이를 구조적으로 분석해 증명함으로써 세포 내 단백질에서의 D-아미노산 도입 기술의 한계를 극복하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다. 또 더 나아가 단백질의 구조와 기능에서 L-아미노산과 D-아미노산의 차이를 규명하는 연구나 D-아미노산과의 상호작용과 같은 관계를 연구 하는데 있어서도 기여를 할 수 있을 것으로 본다.