Generation of CBF triple mutant of Arabidopsis thaliana using the CRISPR/Cas system
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 이병하
- 발행년도 2016
- 학위수여년월 2016. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000059898
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권보호를 받습니다.
초록/요약
C-repeat/DRE-Binding Factors (CBFs) are key transcription factors in plant cold stress tolerance. CBFs induce the expression of many cold responsive (COR) genes that promote cold resistance in plants. Among the four CBF genes in Arabidopsis, CBF1, CBF2, and CBF3 are the genes functioning in cold stress signaling and tolerance. These three CBFs are tandemly located on Arabidopsis chromosome 4 with redundant functions in cold responsive gene regulation. Due to the close proximity of these CBFs on the chromosome, it is almost impossible to generate triple mutants by traditional genetic crosses, which hampers the genetic studies on functions of CBFs under cold stress. The recently developed genome editing tool, the clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated (CRISPR/Cas) system has been shown to successfully generate gene-targeted mutants and multiple mutations in various organisms. In this study, I attempted to generate CBF1, CBF2, CBF3 triple mutants in three different Arabidopsis accessions using the CRISPR/Cas system. I discovered that hygromycin-selected seedlings from each Arabidopsis accessions displayed fairly similar integration levels of both transgenes - Cas9 and small guide RNA (sgRNA) detection and each accession showed different ratios of large deletion in the first and second generation after plant transformation. I also found that the CRISPR/Cas system was able to generate large deletions up to 6550 base pairs length using two sgRNAs to four sites. The successfully isolated triple mutant in C24 harboring the transgene RD29A-LUC (C24RDLUC) background contained a 3633 bp-deletion spanning the parts of CBF1 and CBF3 genes and another 65 bp-deletion in CBF2 gene, which took place at the target sites of CRISPR/Cas. There was no mutation in the other homologous gene, CBF4 in this triple mutant. Preliminary analysis of the homozygote cbf triple mutant seedling morphological phenotypes were not significantly different from it presumed WT siblings and the background line C24RDLUC. I believe that this mutant will be useful for studies on the function of CBF genes and CBF-independent cold signaling pathways.
more초록/요약
C-repeat/DRE-Binding Factors (CBFs) 유전자들은 식물의 저온 순화에 중요한 전사인자이다. CBF 유전자들은 식물이 저온에 내성을 보이게 해주는 여러 유전자들의 발현을 조절한다. 애기장대의 경우 4개의 CBF 유전자를 가지고 있는데 그 중에서 CBF1, CBF2, and CBF3은 저온 스트레스 신호전달과 저온 순화에 기능한다. 이 CBF 유전자들은 애기장대의 4번째 염색체에 나란히 위치하며 저온에 반응하는 유전자 조절 기능을 서로 상호 보완한다. 염색체상에서 CBF 유전자들의 위치가 가깝기 때문에, 전통적인 교배 방식으로는 세 유전자의 돌연변이를 동시에 가지는 돌연변이체를 만드는 것이 불가능하며, 이는 저온에서의 CBF 유전자의 기능을 직접적으로 연구하는데 어려움이 있다. 최근 개발된 유전체 편집 기능인 clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated (CRISPR/Cas) system은 여러 생물군에서 돌연변이체들을 야기하였다. 본 연구에서는 CRISPR/Cas system을 이용하여 세 가지의 다른 애기장대의 accession에 CBF1, CBF2, CBF3 삼중 돌연변이체 제작을 시도하였다. 본 연구에서는 hygromycin에 내성을 보이는 식물들이 accession에 관계없이 비슷한 이식 유전자의 형질전환 성공률을 보이지만 – Cas9과 small guide RNA (sgRNA)의 형질전환, 형질전환 후의 첫 세대와 두 번째 세대에서 accession에 따라 큰 삭제 돌연변이를 보이는 비율이 다르다는 것을 알 수 있었다. 또한, 네 개의 target site를 가지는 두 개의 sgRNA를 이용하여 6550 base pair에 이르는 큰 삭제 돌연변이를 CRISPR/Cas system으로 제작 가능하였다. C24 accession에 RD29A-LUC 유전자가 삽입된 식물 (C24RDLUC)에서 성공적으로 삼중 돌연변이체를 찾았으며, 이 돌연변이체는 CRISPR/Cas의 target site에서 비롯된 CBF1과 CBF3의 이르는 3633 bp 삭제 돌연변이와 CBF2에서 65bp 삭제 돌연변이를 가진다. 이 돌연변이체는 또한 homolog인 CBF4에서 돌연변이를 가지지 않았다. 초기 관찰에서 cbf 삼중 돌연변이체는 정상체로 추정되는 sibling 식물 그리고 정상체 식물과 확연한 크기의 차이는 보이지 않았다. 이 돌연변이체는 향후 CBF 유전자의 기능과 CBF 독립적인 저온 신호전달 연구에 사용될 것이다.
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