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철이온 반응 주화성단백질 Methyl-Accepting Protein의 특성 및 발현 조절기작의 규명

  • 유지홍 (서강대학교 일반대학원)

초록/요약

제 1 장 Characterization of a Methyl-Accepting Chemotaxis Protein (MCP) Regulated by Fur 병원성 세균인 Vibrio vulnificus MO6-24/O는 적어도 55개의 methyl-accepting chemotaxis protein (MCP) 을 암호화하는 open reading frame들을 갖고 있다. 세균의 주화성 반응은 세균의 숙주환경에 대한 특이성과 세균의 독력 정도에 관련이 있기 때문에 MCPs를 이용해 V. vulnificus의 병원성 실험을 수행하였다. 많은 MCPs 중 어떤 mcp가 결여된 돌연변이 균주의 경우 모델 동물의 사망률이 감소하였고 이를 통해 결여된 MCP가 숙주에 감염되어있는 동안 숙주 내 특정 물질을 인식한다는 것을 추축할 수 있었다. 그래서 생쥐 혈청을 이용하여 모세관 주화성 실험을 수행하였다. 그 결과 mcp가 결여된 돌연변이 균주는 혈청을 향한 주화성에 결함이 있다는 것을 알았다. 그 다음으로 혈청의 주요 구성성분들을 이용하여 모세관 주화성 실험을 하였고 이 MCP에 의해 세균이 ferritin을 향해 주화성을 갖는 다는 것을 알 수 있었다. 그러나 철을 갖고 있지 않은 ferritin의 경우 야생종과 mcp가 결여된 돌연변이 균주 간의 주화성의 차이가 없었다. 이 결과를 통해 이 MCP가 철 이온을 인식할 수 있다고 추측하였고 다양한 형태의 철 이온을 이용하여 모세관 주화성 실험을 수행하였다. 그 중 ferric ammonium citrate (FAC), ferric ammonium sulfate (FAS) 그리고 ferric nitrate가 유인물로서 동정되었고 이 MCP를 MCP-F로 명명하였다. mcpF의 발현을 철 침착제가 있는 조건과 없는 조건에서 관찰하였고, 그 결과, mcpF의 발현은 철이 존재할 경우에만 억제되었다. 이는 mcpF의 promoter region에 철과 Fur (ferric-uptake regulator) 의 복합체가 특이적으로 붙음으로써 mcpF의 발현이 억제된다는 것을 DNase Ⅰ footprinting 실험을 통해 알 수 있었다. 그러므로 본 연구에서는 화합물을 포함하는 ferric ion(s)을 인식하는 MCP를 새롭게 동정하였고 이 MCP는 철 이온의 존재 유무에 따라 조절 받는 것을 밝히고자 하였다. 제 2 장 Functional identification of the noble signal molecule produced by Vibrio vulnificus 세균들은 생물막 형성, 독력인자 분비, 그리고 생물발광 등의 행동들을 효과적으로 수행하기 위해 정족수 인식을 통해 유전자 발현을 조절한다. 개체군 밀도 변화에 맞춰 동시에 유전자 발현을 조절하는 정족수 인식은 autoinducer (AI)라는 신호물질에 의해 촉진된다. Vibrio vulnificus에서는 N-acylated homoserine lactone (AI-1) 계열의 합성 유전자인 luxI, luxM과 유사한 유전자가 존재하지 않으나 furanosyl borate diester (AI-2) 계열의 합성 유전자인 luxS가 존재하고 이 신호물질에 의해 주요 독력인자인 elastase (VvpE)가 조절된다. 또한 V. vulnificus의 luxS가 결여된 돌연변이 균주에서 추출한 신호 물질이 AI-1 sensor strain인 A. tumefaciens NT1 (pDCI41E330)에 의해 detection 됨에 따라 또 다른 정족수인식 신호물질이 존재한다는 것을 확인하였고 이 신호물질을 non-AI-2라 명명하였다. V. vulnificus의 신호물질로서 밝혀진 cFP는 A. tumefaciens NT1 (pDCI41E330)에 의해 detection이 되지 않으므로 non-AI-2는 cFP와 다른 신호물질임을 확인하였다. Non-AI-2가 정족수인식 신호물질임을 증명하기 위해 정족수인식에 의해 발현이 증가하는 유전자인 vvpE와 CPS gene cluster의 발현을 non-AI-2를 처리해주고 luxAB fusion을 통해 관찰하였으나 유전자 발현이 증가되는 것은 관찰하지 못하였다. 또한 elastase의 발현증가를 확인하고자 2% skim milk plate에 균주들을 spotting한 후 non-AI-2를 처리하고 관찰하였으나 앞서 관찰한 luxAB fusion에서와 같이 차이를 볼 수 없었다. 다음으로 정족수인식에 의해 양성 조절을 받아 생물막의 크기를 줄이는 역할을 하는 capsular polysaccharide의 영향을 non-AI-2를 처리 조건에서 관찰하였다. 예상과 달리 생물막이 증가하였다. 그래서 이때 어떤 단백질들의 양이 변화하여 생물막이 증가하였는지 관찰하기 위해 단백질들을 각각 secretome과 cytoplasmic protein으로 나누어 분석하였다. 이전 연구에서 생물막 형성과 관련된 단백질인 LexA가 본 연구에서는 non-AI-2를 처리한 세포에서 증가된 단백질로서 동정되었다. 이를 통해 non-AI-2에 의해 induction된 LexA가 생물막 형성 증진에 영향을 미칠 것이라 추측할 수 있었다.

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초록/요약

Chapter 1. Characterization of a Methyl-Accepting Chemotaxis Protein (MCP) Regulated by Fur A human pathogenic bacterium, Vibrio vulnificus MO6-24/O has at least 55 ORFs coding for the putative MCPs. Since bacterial chemotactic responses are related to its specificity to host environments and its degree of virulence, the MCPs involved in V. vulnificus pathogenicity were examined. An mcp mutant showed attenuated mortality of a model animal, suggesting this MCP senses certain host components while infecting the hosts. Capillary chemotaxis assay using mouse serum revealed that this mutant was defective in moving towards serum. Subsequent assays using major constituents of serum showed that ferritin was responsible for bacterial attraction via this MCP. Iron-free form of ferritin, however, did not differentiate the motilities of the wild type and mutant strains, suggesting that iron ion(s) could be sensed by this MCP. Among various types of iron ions, ferric ammonium citrate, ferric ammonium sulfate and ferric nitrate was identified as an attractant, and thus it was named as MCP-F. Expression of mcpF gene was monitored in the absence and presence of an iron chelator and it was repressed by iron. Iron-repression was mediated via specific binding of iron-Fur complex to the mcpF promoter region. Therefore, this study demonstrates that a newly-identified MCP sensing ferric ion-containing compounds is regulated iron. Chapter 2. Functional identification of the noble signal molecule produced by Vibrio vulnificus The expression of genes related to biofilm formation, virulence factors and bioluminescence in bacteria is regulated via quorum sensing. Autoinducer triggers quorum sensing which regulates the gene expression via cell-density dependent manner. The genome of Vibrio vulnificus do not have luxI and luxM coding synthase for N-acylated homoserine lactone (AI-1). But, there is luxS coding synthase for furanosyl borate diester (AI-2) which regulates major virulence factor, elastase, VvpE. In this study, extracted signal molecule from cultured medium of the ?luxS was detected by AI-1 sensor strain, A. tumefaciens NT1 (pDCI41E330). So, we speculated that there is another signal molecule related quorum sensing. And another signal molecule was named as non-AI-2. cFP known as signal molecule in V. vulnificus was not detected by A. tumefaciens NT1 (pDCI41E330), non-AI-2 was different to cFP. To testify whether non-AI-2 is quorum sensing signal molecule, we monitored the expression of vvpE and CPS gene clusters under non-AI-2 treated condition. But, we could not monitor increased genes expression. VvpE induction also did not effected by non-AI-2. However, when we treated exogenously biofilm to the non-AI-2, the biofilm was increased. So, we analysis the proteom increased or decreased by non-AI-2.

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