Characterization of two microbial rhodopsins from Cyanobacteria
- 주제(키워드) rhodopsin , cyanobacteria
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 정광환
- 발행년도 2015
- 학위수여년월 2015. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000056231
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권보호를 받습니다.
초록/요약
Photo-active proteins, rhodopsins, using retinal (vitamin A) as a chromophore are found in both prokaryotes and eukaryotes. Microbial rhodopsins are seven α ? helices transmembrane proteins that form a pocket surrounding retinal. Halorhodopsin(HR) and bacteriorhodopsin(BR) play a role of light driven inwardly chloride ion pump and outward proton pump, respectively. These two rhodopsins have similar protein structure although they have less amino acid homology (25%). Previous studies showed that a key residue mutant of BR functions like an HR, but the corresponding reverse mutation in HR did not function as BR. According to alignment based on the amino acid sequences, one opsin gene PCC10023 that we found from Scytonema, Cyanobacteria is close to BR. Interestingly, it possess critical residues of HR. The absorbance maximum of PCC10023 appeared at 536 nm that is substantially blue-shifted state for that of BR and HR. Through the light induced pH change measurements, PCC10023 has the light - driven inwardly chloride ion pumping activity dependent chloride ion concentration like HR. In the acidic condition, the amount of proton pumping of PCC10023 is increased. Another characteristic of PCC10023 is proton acceptor Asp96, which is charged residue such as proton donor of BR. The results of PCC10023 D85A and D85G mutant showed that it did not affect chloride ion pumping activity. Especially, I found that interesting function?altering change by PCC10023 T75D mutant. These results support that HR and BR are closely related not only evolutionarily but also functionally. I suggest that new PCC10023 is an evolutionarily intermediated rhodopsin between BR and HR in diverse bacterial rhodopsins. Also, another opsin gene is ASR like PCC7513 from Gloeocapsa, Cyanobacteria. Typically, Anabaena sensory rhodopsin (ASR) and its transducer work together as photochromic sensor. PCC7513 does not consist of a gene that encodes its transducer under the same promoter. The absorbance maximum of PCC7513 appeared at 548 nm that is close to λmax of ASR. Through HPLC analysis, the chromophore configuration of PCC7513 showed 100% 13-cis retinal under dark condition and its configuration changed to 40% All-trans retinal and 56% 13-cis retinal after 1min illumination. Change ratio of its chromophore configuration is similar with that of ASR. I also made mutants of PCC7153 and ASR - D217E and D217N - which are a key residue involved in proton transport pathway. I compared their proton pumping activity. Aspect of changing proton pumping activity in PCC7513 mutants is analogous with ASR mutants. D217E mutants and D217N mutants respectively showed increase and decrease of proton pumping activity. I confirmed that PCC7513 is similar with ASR in their photocycle process considering change of retinal isomer form and proton pumping activity of mutant.
more초록/요약
진핵생물과 원핵생물 모두에서 발견되는 로돕신은 비타민A인 레티날을 발색단으로 사용하면서 빛에 반응 할 수 있는 단백질이다. 대부분 미생물 로돕신은 일곱 개의 연결된 단백질로 구성되어있는데 이들은 막을 관통하고 레티날 주변을 둘러싸고 있다. 염소이온을 막 외부에서부터 내부로 이동시키는 할로로돕신과 수소이온을 막 내부에서 외부로 이동시키는 박테리오돕신은 전체적인 아미노산 서열에서 상관관계가 매우 낮을지라도 구조적으로는 매우 유사하다. 이전의 박테리오로돕신의 중요한 잔기를 할로로돕신의 중요한 잔기로 치환시켰을 때, 기능의 전환이 관찰되는 것으로 증명되었고 그 반대인 박테리오로돕신의 역할을 하는 할로로돕신의 돌연변이는 아직까지 알려지지 않았다. 극한 환경에서 사는cyanobacterium scytonema 에서 발견된 로돕신 PCC10023은 아미노산 서열 비교에서 박테리오로돕신과 유사했지만 할로로돕신의 중요한 잔기를 갖고 있었다. PCC10023은 536 nm 정도의 파장을 흡수하였고 빛을 받을 때 생기는 pH의 변화를 통해 PCC10023은 염소이온 농도에 의존하여 직접적으로 염소이온을 막 내부로 이동시킨다는 것을 밝혀냈다. 산성의 pH에서는 이온의 수송 능력은 더 증가되는데 이는 극한 환경이라는 진화의 과정에서 습득된 기능이라고 생각된다. PCC10023는 박테리오로돕신에서 수소이온 공여체로서 보존된 잔기가 존재했다. 이를 변형시켜도 PCC10023의 기능은 변함이 없었다. 흥미롭게도, 염소이온이 붙는 잔기를 박테리오로돕신처럼 전하를 띄는 잔기로 치환하였을 때 기능의 치환이 관찰되었으며 위 결과를 바탕으로 박테리오로돕신이 다양한 환경에 적응해나가면서 진화적으로 할로로돕신으로 진화해가고 있을 때, PCC10023은 그들의 중간체라고 예측했다. 또한, 극한 환경에서 사는 cyanobacterium Gleocapsa에서 발견된 로돕신 PCC7513은 아미노산 서열 비교를 통해 ASR과 유사한 로돕신으로 예측되었다. ASR은 빛을 받아 ASR의 transducer에 신호를 전달하고 신호를 받은transducer는 유전자발현에 관여한다. 하지만 PCC7513은 같은 프로모터상에서 PCC7513의 transducer를 암호화하는 유전자는 존재하지 않았다. PCC7513은 ASR과 가까운 흡수율(548 nm)로 나타났다. HPLC를 통해 PCC7513의 레티날 형태는 암적응이 된 상태에서 100% All-trans retinal 이었고, 빛을 주었을 때 40% All-trans retinal 그리고 56% 13-cis retinal으로 구성되어있다는 것을 확인했다. 빛에 의한 PCC7515의 레티날 형태 변화 비율은 ASR과 거의 유사했다. 그리고 PCC7513과 ASR에서 proton pumping에 관여하는 잔기의 돌연변이에 따라 수소이온을 이동시키는 능력에서의 차이가 비슷했으며 구조적으로는 매우 유사하다는 것을 증명했다.
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