Visualization of Biochemical Reaction in Large DNA Molecules
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 조규봉
- 발행년도 2015
- 학위수여년월 2015. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 화학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000056194
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권보호를 받습니다.
초록/요약
Long and linear DNA molecules are the mainstream single-molecule analytes for a variety of biochemical analysis within microfluidic devices including functionalized surfaces and nanostructures. However, for biochemical analysis, large DNA molecules have to be unraveled, elongated and visualized for obtaining biochemical and genomic information. To date, elongated DNA molecules have been exploited for a number of developments for genome analysis systems as well as for the study of polymer physics due to the advantage of direct visualization of single DNA molecules. Moreover, each single DNA molecule provides individual information, which makes it useful for stochastic event analysis. Therefore, numerous studies of enzymatic random motions have been performed on a large elongated DNA molecule. In this thesis, we introduce how to elongate DNA molecules using microfluidics and nanostructures in the beginning. We present nanoslit confined DNA conformations at very low ionic strengths and a theory to explain most measurements for single DNA molecule size under strong nanoslit confinement. Very low ionic strength conditions not only increase the DNA persistence length dramatically but also cause DNA molecules to swell to the extent that the effective diameter of DNA becomes larger than the nanoslit height. By accounting for these effects, our results and theory provide a reasonable clue for a current controversy regarding the dependence of the DNA conformation on slit height (h), persistence length (p), and effective diameter (w). Second, we discuss how elongated DNA molecules have been utilized to obtain biochemical and genomic information visualized directly from DNA molecules. We demonstrate a single molecule analytical approach for the visualization of reactive oxygen species (ROS) induced DNA damage, such as base oxidations and single stranded breaks in large DNA molecules. Our approach consists of Fenton reaction to generate ROS-induced DNA damage, enzymatic treatment using the mixture of three types of glycosylases to remove oxidized bases, and fluorescent labeling on damaged lesions using DNA polymerase I. Our single molecule analysis provided the capability to count one or two damaged sites per ? DNA molecule (48.5 kb), and reliable and quantitative values were observed with the increase of hydrogen peroxide and ferrous ions at micromolar level. More importantly, labeled damaged sites that were visualized under a microscope provided positional information, which offered the capability of comparing DNA damaged sites and in silico genomic map to reveal sequence specificity. Consequently, single DNA molecule analysis provides the most sensitive analytical approach for ROS-induced DNA damage and a meaningful biochemical insight that a specific sequence such as GTGG is more sensitive to reactive oxygen species.
more초록/요약
단일 분자DNA 의 광학적 분석방법은 1980년대 일본 교토대학의 Mitsuhiro Yanagida 교수 연구팀에 의해 발표된 최초의 광학 현미경(Optical microscope)을 통한 단일 분자 DNA의 관찰로부터 시작되었다. 이 방법은 생물학적 분자들의 연구에 있어 새로운 시각을 가져왔을 뿐 만 아니라 이후에 새로운 생물학적 거대 DNA 분자의 분석 방법들이 개발되는 촉매의 역할을 하였다. 단일 분자의 영상화는 기존의 벌크 시스템과 다르게 앙상블 평균 값이 아닌 각각의 단일 분자의 확률적인 분포와 시간에 따른 변화를 관찰 할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 따라서, DNA와 같은 생물학적 고분자 구조의 물리적 현상에 대한 실험이 용이한 시스템이며, 수용액상에서의 단일분자 DNA 의 신장에 관한 동역학과 정역학의 연구를 하기에 매우 좋은 분석 시스템이다. 이 논문에서는 먼저 DNA의 이온농도를 조절하여 고분자의 물성을 변화시키는 방법을 이용한 나노슬릿 내부에서의 DNA 신장 현상에 대한 연구를 진행하였다. 이 논문에서는 먼저 이온농도의 변화에 의한 DNA의 persistence length의 변화에 대한 이론적 수식인 OSF equation과 Dobrynin equation에 대한 실험적 검증을 하였으며, 또한 이를 이용한 Odijk과 de Genne에 의하여 제안 되었던 나노 구조물의 크기와 DNA의 신장 현상에 대한 이론들에 대한 실험적인 검증을 하였다. 그 결과 낮은 이온농도에서는 DNA의 persistence length 뿐 만 아니라 Stigter’s equation에서 제안 되었던 DNA의 effective diameter 에도 영향을 준다는 사실을 알게 되었다. 이는 DNA의 이온농도를 낮추어 줄 경우 기존에 잘 알려져 있던 것처럼 DNA가 persistence length의 증가로 인하여 뻣뻣해 질 뿐만 아니라 effective diameter 의 증가로 인하여 실제 DNA의 지름보다 불어난 가상의 반지름을 가지는 것처럼 행동 한다는 사실에 대한 최초의 실험이다. 이러한 실험은 단일 분자를 이용하여 낮은 이온 농도에서의 DNA의 신장 현상에 대한 분석이 가능했다는 점과 다른 연구 그룹에서는 고려하지 않았던 effective diameter의 영향에 대하여 분석하였고, 논쟁이 되고 있던 다른 그룹들 간의 연구 결과들에 대한 해석까지 가능하게 되었다는 장점을 가지고 있다. 단일 분자 DNA의 분석 방법의 또 다른 장점은 외부의 스트레스에 의한 DNA 손상 등과 같은 분자간의 확률적인 무작위 반응의 분석이 용이하다는 점이다. 세포 유전자의 전반적인 DNA 손상의 정량화는 질병 의 초기 진단, 치료 및 치료과정에 대한 평가의 지표로 사용될 수 있는 잠재력을 가지고 있으며 매우 중요한 분야이다. 이 논문에서는 단일 분자를 이용하여 이러한 DNA 손상을 분석 할 수 있는 방법을 새롭게 제시하였다. 이러한 단일 분자를 이용한 이중나선 절단의 분석은 기존의 방법들에 비하여 향상된 민감도를 보여주며, 뿐 만 아니라 더욱 민감도를 높인 방법을 개발하였다. 그 결과 극미량의 조사량에 의한 DNA 단일 가닥의 손상을 분석 할 수 있게 되었고, 뿐만 아니라 DNA 손상이 어떠한 서열에 특별히 존재 하는지에 대한 분석도 가능하게 되었다. 단일분자 수준에서의 DNA 손상에 대한 분석하는 연구는 다양한 손상 원인에 적용 될 수 있는데, 이 논문에서는 자외선뿐 만 아니라 ROS(Reactive Oxygen Species)에 의한 DNA의 손상에 대한 분석에 대한 분석 가능성을 보여주었다. 단일 분자를 이용한 DNA 손상 분석 연구는 손상의 위치를 지도화 할 수 있을 뿐 만 아니라 손상된 정도의 정량화가 쉽다는 장점을 가질 것으로 예상되며, 또한 앞으로 생물학적 분자들의 연구에 있어 새로운 시각을 가져올 수 있을 것이라고 생각한다.
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