Biopolymer Sequencing Using Various Mass Spectrometric Techniques
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 오한빈
- 발행년도 2015
- 학위수여년월 2015. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 화학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000055443
- 본문언어 한국어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권보호를 받습니다.
초록/요약
Part 1. MALDI-TOF In-Source Decay Mass Spectrometry for Oligonucleotide Biopolymer De Novo Sequencing 현재까지 ESI나 MALDI-TOF와 같은 질량분석법의 발전은 올리고 핵산의 서열분석을 더욱 간편하게 할 수 있도록 해주었다. 그 중 MALDI-TOF In-Source Decay를 이용한 분석법은 다른 분석법과 비교하여 더욱 쉽고 빠르고 적은 양의 시료를 요구하는 탠덤 질량 분석법이다. 본 연구에서는 MALDI-TOF ISD 분석법을 이용하여 올리고 핵산의 de novo 서열분석을 하였다. A, T, G, C만으로 이루어진 4종류의 13-mer 올리고 핵산에 대한 ISD 실험을 통하여 염기의 단편화 효율성을 알아보았고, 특정 염기를 다량 포함하는 4종류의 13-mer 올리고 핵산과 임의의 서열을 가지는 13-mer, 15-mer의 올리고 핵산에도 적용하여 de novo 서열분석을 수행하였다. 단편화의 결과로 주로 w-형태의 이온이 가장 많이 출현했으며, 따라서 w-이온의 peak 간 질량 차이 값을 통하여 de novo 서열분석을 성공적으로 수행하였다. Part 2. One-Step Peptide Backbone Dissociations in the Various Types of Mass Spectrometer Using TEMPO-based Free Radical Initiated Peptide Sequencing Approach TEMPO-기반 FRIPS (Free Radical Initiated Peptide Sequencing) 분석법은 안정한 라디칼 물질인 TEMPO (2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl) 를 라디칼 개시제로써 이용하여 충돌활성화를 통해 radical-driven 펩타이드 골격분해를 유발하여 펩타이드의 서열을 분석한다. o-TEMPO-Bz-C(O)-NHS (N-hydroxysuccinimide ester) 와 펩타이드를 합성하여 얻은 o-TEMPO-Bz-C(O)-펩타이드를 Iontrap 장비를 이용하여 충돌활성화 시키면 벤질 라디칼 화합물이 생성되고 (⦁Bz-C(O)-펩타이드) 이렇게 생성된 벤질 라디칼 화합물에 에너지를 한번 더 가하면 펩타이드의 단편화가 일어나게 된다. 따라서, 펩타이드의 골격을 분해하기 위해서는 두 단계의 충돌활성화 과정을 거쳐야 하므로 이를 개선하기 위하여 높은 충돌활성화 에너지를 가할 수 있는 Q-TOF와 Orbitrap 장비를 이용하여 일-단계 TEMPO-FRIPS 분석을 수행하였다. o-TEMPO-Bz-C(O)-펩타이드에 높은 충돌활성화 에너지를 가하였을 때 벤질 라디칼 화합물의 생성뿐만 아니라 펩타이드 골격의 분해까지 일어나는 것을 확인하였고, 결과적으로 높은 충돌활성화 에너지를 가하여 양이온모드에서 일-단계 TEMPO-FRIPS 분석이 가능함을 알 수 있었다.
more초록/요약
Part 1. MALDI-TOF In-Source Decay Mass Spectrometry for Oligonucleotide Biopolymer De Novo Sequencing In recent years, development of mass spectrometry has made it facile to analyse the sequence of oligonucleotides. In particular, MALDI-TOF in-source dacay (ISD) has emerged as a useful tandem mass technique, due to its easy implementation, high analysis speed, and a little sample requirement. In this study, de-novo sequencing of oligonucleotides was carried out by MALDI-TOF ISD method with a particular goal of exploring the oligomer sequence dependence on the MALDI-TOF ISD performance. We evaluated the performances of MALDI ISD by changing DNA base compositions and monitoring the fragmentation efficiency. And then we performed de-novo sequencing of specific base-rich 13-mer oligonucleotides and 13-mer and 15-mer oligonucleotides that include random sequence. Consequently, a series of w-type fragments were found to be useful for DNA oligomer sequencing, particularly, for 13-mer, 15-mer oligonucleotides. Part 2. One-Step Peptide Backbone Dissociations in the Various Types of Mass Spectrometer Using TEMPO-based Free Radical Initiated Peptide Sequencing Approach TEMPO-based FRIPS (Free Radical Initiated Peptide Sequencing) is a method using TEMPO (2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl) as a radical initiator to sequence peptide by collision-activated dissociation. Peptides of interest were conjugated with o-TEMPO-Bz-C(O)-NHS at the position of the N-terminus for TEMPO-based FRIPS application. Here, two step collisional activations are needed to be implemented for FRIPS analysis by Iontrap instrument, that is, MS3 is required, since FRIPS can yield peptide backbone dissociations with two collisional activations; one for the radical generation (⦁Bz-C(O)-peptides) and the other for peptide backbone dissociations. So, in order to reduce a collisional activation step, we used instruments such as Q-TOF, Orbitrap which can apply high-collisional energy. When high-collisional activation was applied to o-TEMPO-Bz-C(O)-peptide, not only homolytic cleavage in the bond between benzyl carbon and oxygen of the TEMPO group but also peptide backbone fragmentation was occurred. Consequently, peptide sequencing was possible in a single-step FRIPS was possible in the positive-ion mode by applying high-energy collisional activation.
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