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Generation of Light-induced Membrane Potentials from Proteorhodopsin incorporated lipid vesicles

초록/요약 도움말

Proteorhodopsin (PR) is a photoactive transmembrane protein, which is functioning as a light-driven proton pump in marine bacteria. In biological systems, light stimulates the PR to generate proton motive force from proton gradients. We reconstituted PR into lipid vesicles that could be applied to artificial devices for energy storages. There are a variety of methods such as microelectrodes, NMR and fluorescent pH indicators to measure intracellular pH. Fluorescent pH indicators could be used for precise real-time measurements and they do not cause destruction of lipid membrane. Especially, ratiometric pH indicators could detect the membrane potentials of rhodopsin incorporated lipid vesicles (proteoliposomes) in situ, and their light-driven pH variation have presented. Detection technique using the ratiomitric pH indicators was proved effective methods for sensitive analysis because they are not influenced by temperature changes and photobleaching. We monitored microscopic changes inside a single vesicle, not bulk approaches which have limitations (e.g., average of all reactions). Consequently, visual detection of light-induced membrane potentials at a single vesicle level was achieved with SNARF-1, which is one of ratiometric pH indicators, using confocal microscopy. We monitored the ratio of the SNARF-1 intensity at 560 – 600 nm (yellow-orange) and 620 – 660 nm (deep red) for excitation at 532 nm and estimated the average rate of intavesicular pH changes (20 um-sized vesicles) was 2.2 x 10^-3 ΔpH/sec at 1.5mW/cm2.

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초록/요약 도움말

프로테오로돕신(PR)은 해양 세균에 존재하는 광감각 단백질로서 빛에 의해 양성자를 이동시킨다. 생명체 내에서, PR은 빛에 의해 세포안과 밖의 이온차이를 형성하고 이를 통해 양성자 구동력을 형성시킨다. 우리는 PR을 리피드 베지클에 재조합시키고 에너지 저장을 위한 인공적인 디바이스로 응용하고자 하였다. 세포 내부의 pH를 측정하기 위해서 미소전극, NMR spectroscopy, 형광을 내는 pH 센서를 이용하는 방법들이 있다. 형광을 내는 pH 센서는 정확하게 실시간으로 pH를 측정할 수 있으며, 지질 막을 파괴하지 않고 세포 내부 환경을 측정할 수 있다. 특히, 비율계량 pH 센서는 로돕신이 재조합된 베지클 (프로테오리포좀)의 막 전위를 측정하기 위해 널리 사용되는 방법으로, 빛에 의한 pH 변화를 확인할 수 있다. 이 관찰 기술은 온도 변화와 형광퇴색 등에 영향 받지 않는 감도 높은 분석 방법이다. 우리는 모든 반응의 평균 값을 나타내는 벌크 상태에서의 관찰이 아닌, 하나의 베지클 하에서의 미세한 변화를 관찰하였다. 결과적으로, 비율계량 pH 센서 중 하나인 SNARF-1을 이용하여 컨퍼칼 현미경 관찰 하에 빛에 의한 막 전위 생성을 시각적으로 감지하였다. 이를 위해 560 nm와 600 nm 사이(밝은 주황색)의 파장과 620 nm와 660nm (짙은 빨간색)의 파장의 비율을 분석한 결과, 약 20 m 크기를 가진 프로테오리포좀 내부의 평균 pH 변화율이 1.5mW cm-2 빛 조건하에서 2.2 x 10-3 ΔpH sec-1 로 측정되었다.

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