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Cav3.1 칼슘채널의 PKC 의존성 인산화 부위 탐색과 특성 연구

초록/요약 도움말

T-type Ca2+ channels are modulated by membrane potential changes, and numerous signaling molecules including protein kinases. Recently, our group reported that PMA-mediated activation of PKC strongly augmented Cav3.1 activity. To locate PKC phorphorylation sites, I constructed 13 single or double mutants for which Ser or Thr residues in the II-III loop were mutated to Ala. The mutant channels were expressed in Xenopus oocytes, and their currents were recorded by a two electrode voltage clamp method. When PMA was applied, all the mutant currents were increased by 2-2.5 fold over 15 min, suggesting that their PMA stimulation profiles were similar to wild-type Cav3.1 (Cav3.1/WT). Among the mutant channels, interestingly, the current amplitude of Cav3.1/S1170,1171A was smaller than that of Cav3.1/WT. In contrast, the current amplitude of Cav3.1/S1170,1171D was bigger than Cav3.1/WT. These findings suggest that phosphorylation of Ser1170 and Ser1171 may be involved in regulation of Cav3.1 activity.

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초록/요약 도움말

T-형 칼슘 채널은 세포막의 막전위 변화 뿐 아니라 다양한 신호 전달 물질들에 의해 조절된다. 선행 연구에 따르면 T-형 칼슘 채널의 아형인 Cav3.1은 PKC의 활성 촉진제인 PMA에 의해 전류의 크기가 증가하며 PKC에 의해 Cav3.1의 II-III 루프가 인산화됨으로 인해 전류 증가가 일어난다고 제시되었다. 본 연구에서는 II-III 루프의 어떤 부위에 인산화가 되어 채널의 활성이 증가하는지 알아보고자 PKC의 consensus 서열에 해당하는 세린 또는 트레오닌 후보 잔기를 알라닌으로 치환시킨 돌연변이체를 제작하고, 각각을 개구리의 미수정란에 발현시켜 전위 고정법으로 채널의 전류를 측정하였다. PMA (300 nM)를 처리하였을 때 Cav3.1/WT과 돌연변이체 모두 2-2.5배 정도로 채널의 활성이 증가하는 것을 보였다. 이 결과들은 점 돌연변이 시킨 세린 또는 트레오닌이 PMA에 의한 전류 증가 효과에 관련이 없을 가능성을 제시한다. 흥미롭게도 돌연변이 채널들 중에서 Cav3.1/S1170,S1171A의 전류 크기는 Cav3.1/WT에 비해 60.5% 작게 측정되었다. 반면 Ser1170과 Ser1171을 음전하를 띠는 아스팔산으로 돌연변이 시킨 Cav3.1/S1170,S1171D 의 전류 크기는 Cav3.1/WT보다 58.9% 크게 측정되었다. 이 결과는 Ser1170과 Ser1171의 인산화 정도가 채널 발현에 관련되어 있다는 가설을 지지한다. 즉, II-III 루프의 Ser1170과 Ser1171 두 아미노산의 인산화가 Cav3.1의 전류 크기를 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다.

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