Expression of a Seven-transmembrane Protein and Its Application for Energy Production
- 주제(키워드) 도움말 rhodopsin , seven-transmembrane protein
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 정광환
- 발행년도 2013
- 학위수여년월 2013. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 도움말 일반대학원 바이오융합기술협동과정
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000052512
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작권 보호를 받습니다.
초록/요약 도움말
몇몇 미생물은 발색단인 레티날이 붙어있는 7회-막관통단백질인 로돕신을 가지는데, 이 단백질은 빛을 흡수하여 세포로의 광신호전달에 관여하거나 세포 안팎으로 이온을 수송하는 역할을 한다. 주로, 로돕신에 붙어있는 레티날의 주변의 아미노산들의 특성으로 인해 레티날 바인딩 포켓의 모양 및 로돕신의 최대 흡수 파장이 결정된다. 레티날 바인딩 포켓의 아미노산들은 미생물 로돕신 간에 대체로 보존이 되어있는데, 그 중에서 아나베나 센서 로돕신 (ASR) 의 레티날의 베타-이오논 고리의 3번째와 4번째 탄소 옆에 존재하는 135번째 글라이신은 다른 미생물 로돕신에서 알라닌, 세린, 그리고 시스테인으로 보존이 되어 있었다. 이 위치에 존재하는 아미노산의 특성이 로돕신의 광화학적 성질에 어떤 영향을 미치는지 ASR 외 세 가지의 서로 다른 로돕신의 돌연변이 연구를 통하여 알아보았다. 그 결과, 시스테인보다 부피가 큰 아미노산이 위치할 경우 적절한 레티날 결합부위를 형성하지 못하였다. 반면, 시스테인보다 부피가 작은 아미노산이 위치할 경우에는 부피가 보다 클 수록, 아미노산의 극성이 보다 클 수록 보다 장파장의 최대흡수파장을 가지는 상관관계를 확인하였다. 하지만 고유의 기능에는 큰 변화가 없음을 확인하였다. 따라서 이 위치는 각 로돕신 고유의 최대흡수파장 결정 및 적절한 레티날 결합부위 형성에 한 역할을 담당함으로써 미생물로 하여금 주변 생활 환경에 가장 풍부한 파장의 빛을 효율적으로 이용할 수 있게 한다. 원핵생물 로돕신과는 달리 진핵생물 로돕신은 대장균에서의 대량발현이 용이하지 않다. 그러나 바실러스 서브틸리스에서 분리한 미스틱 단백질을 진핵생물 유래 로돕신인 아세타블라리아 로돕신 I 과 클라미도모나스 센서 로돕신 B 각각의 아미노 및 카르복시 말단에 모두 융합시킴으로써 대장균에서는 처음으로 두 단백질을 정제하였다. 그 분광학적 분석을 통해 아세타블라리아 로돕신 I의 수소이온 펌핑에 관여하는 두 가지 중요한 잔기, 즉 수소이온 공여체와 수용체를 발견하였고, 또한 클라미도모나스 센서 로돕신 B의 특성을 확인하였다. 수소이온을 막 안쪽에서 바깥쪽으로 펌핑하는 로돕신인 중에서 주로 야생형 GR의 펌핑 효율이 좋은 것으로 나타났다. 따라서 이를 대장균에 발현시킨 후 반전 막을 제조한 후 빛을 조사하여 막간 수소이온농도 구배를 형성시킴으로서 대장균 막에 존재하는 ATP 생성효소에 의해 ATP가 생성되는 시스템을 제조하였다. 이때 활성도는 1 밀리그램의 GR 당 1분에 약 0.05 나노몰의 ATP를 생성하는 것으로 나타났다. 또한 생성된 ATP는 산업적으로 유용한 물질인 옥살산을 생성하는 피브루산 카복실라아제 반응에 이용되어 옥살산을 생성하였다. 이때 효소 활성도는 1 밀리그램의 피브루산 카복실라아제 당 1분에 약 0.16 마이크로몰의 피브루산을 옥살산으로 변환시키는 것으로 나타났다. 위 시스템은 세포가 필요없는 반응으로서 생성물의 분리 및 산업적 이용에 용이하며 환경적으로는 공기 중의 이산화탄소를 빛 에너지를 이용해 유기물에 고정시킴으로서 온실가스 감축에 기여할 수 있다.
more초록/요약 도움말
Microbes have retinal-binding seven-transmembrane proteins called microbial rhodopsins that have two distict functions: sensory transductioin and ion transport. Characteristics of amino acids around the retinal usually determine ths shape of retinal binding pockets and absorption maxima of rhodopsins. Amino acids in retinal binding pocket are usually conserved among microbial rhodopsins. According to the sequence alignment of several microbial rhodopsins, 135th residue of Anabaena Sensory Rhodopsin (ASR) that is close to the C3 and C4 methyl group of the -ionone ring of the retinal is conserved as at least 3 amino acids, Gly, Ser, and Ala in other microbial rhodopsins. Mutational approach was used in order to investigate whether characteristics of different amino acids that exist in this position affect photochemical properties of ASR as well as other three different kinds of microbial rhodopsins. As a result, rhodopsin has failed to form into proper retinal-binding pocket when amino acids that have larger volume than cysteine are located in the position. On the contrary, when amino acids that have smaller volume than cycteine are located, it had a tendency to have a correlation that the larger volume and/or the more polarity it has, the more red-shifted absorption maximum it has. Its own function, however, have not mostly affected. Therefore, this position of rhodopsin seems to have a role for forming absorption maximum and proper retinal-binding pocket, so that it contributes to the proper wavelength absorption for the organism to adapt the environment where they live in. A lot of effort needs to express eukaryotic rhodopsins in E. coli unlike microbial rhodopsins. It was succeded to express and purify Acetabularia rhodopsin I (ARI) and Chlamydomonas sensory rhodopsin B (CSRB) from E. coli by fusing Mistic which is from Bacilus subtilis both to N- and C- terminal of those rhodopsins. By spectroscopic analysis, proton donor and acceptor residues were determined, which participate in proton transfer of ARI, and also confirmed properties of CSRB. Gloeobacter rhodopsin (GR) has better pumping efficiency among proton pumping rhodopsins studied here. Using E. coli inverted membranes expressing GR that can generate proton gradient across the membrane upon illumination, ATP was successfully synthesized in vitro through endogenous ATP synthase. The ATP synthase activity was about 0.05 nmol of ATP/min/mg of GR. The synthesized ATP, in turn, could successfully be coupled to ATP-hydrolyzing bio-process such as a process by pyruvate carboxylase (PC) that catalyses the ATP-dependent carboxylation of pyruvate to oxaloacetate which is useful material for bio-industy. The PC activity was 0.16 unit/mg of PC. This cell-free system would be useful to separate desire products from reaction mixtures and to be able to utilize bio-industrial usage. In respect of environmental point of view, carbon dioxide in the air can be fixed into organic acid by enzymatic reaction, which could contribute to reduction of greenhouse gas emissions.
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