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Improvement of Fatty Acid Production in Escherichia coli by Engineering Fatty Acid Biosynthesis (FAS) Pathway

  • 이선희 (서강대학교 화공생명공학과)

초록/요약 도움말

Recently, the advancement of industrial and social activities has raised problems such as global warming and the energy crisis. These problems result from the excessive and wasteful usage of fossil fuels in numerous industrialized countries. To be considered “green”, future industrial technologies should be developed with renewable resources and decrease in CO2 emissions as their core basis. A bacterial energy system utilizing biomass is a typical example of a recycling system. To overcome the limitations of existing biofuels, alternative fermentation-renewable fuels are being considered, including higher alcohols, lipid and fatty acids derived from microbes. Fatty acids which produced by microbial, bio-fuels (bio-diesel) as well as raw materials for cosmetics, pharmaceutical raw materials in the industries of high value may be used. Microorganisms have been used for biodiesel (fatty acid methyl ester, FAME) production due to their significant environmental and economic benefits. The goal of the present research was to develop new strains of Escherichia coli and to increase the content of total fatty acids (TFAs) and free fatty acids (FFAs) by fatty acid biosynthesis (FAS) metabolic engineering analysis. The genes encoding essential enzymes that are involved in the initial step, elongation cycle step, termination step of FAS recombined sequentially. Improvements of fatty acid production and fatty acid composition were investigated using the expression of several genes at the same time. The E. coli were manipulated as over-expression of ACC (accA, accBC), fabD and fabH genes was induced in the initial step of the fatty acid biosynthesis. The production of hexadecanoic acid (C16) was especially enhanced up to approximately 4.8-fold in E. coli SGJS13 (containing the accA, accBC, fabD and fabH genes) as compared to E. coli SGJS11 (containing the fabH gene). The novelty of this present study lies in the fact that multiple biosynthetic genes in elongation steps were simultaneously over-expressed (fabG, fabZ, fabI and fabH genes), allowing us to compare and analyze the production and composition of long-chain fatty acids in recombinant E. coli strains. We successfully developed a new experimental method to improve the unsaturated fatty acid content (about 20-fold) in bacterial cells. The ratio of saturated fatty acids (SFAs) and unsaturated fatty acids (UFAs) is important factor that determines the quality of bio-fuels. Enhancement of UFAs can increase the probability of usage as a bio-fuel such as biodiesel and jet fuel. In addition, to verify the results, NAD+/NADH ratios and analyses of carbon source consumption and organic acids production were performed. Finally, to increase TFAs and FFAs production in E. coli, codon optimized bacteria acyl-ACP thioesterase genes of FAS termination step, and the gene involved in fatty acid degradation was removed. Recombinant E. coli which inserted with the bacteria codon-optimized acyl-ACP TE genes (OPSpTE, OPLlTE, OPEfTE and OPBcTE) demonstrated the highest TFAs and FFAs content; in particular, the content of C12 and C14 FFAs was about 3-5-fold, and the content of C18:1 and C18:2 FFAs content about 8-42-fold higher than that in the control E. coli. Furthermore, this study researched the carbon sources (including industrial carbon source such as crude glycerol and molasses) and nitrogen sources for optimized culture conditions. The metabolic engineered E. coli presented in this study is expected to be more economical for producing fatty acids in quality biodiesel production processes.

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초록/요약 도움말

화석연료의 고갈로 인한 고유가 시대 대비와 온실가스 저감화를 위해 환경 친화적인 바이오 화합물 개발에 대한 관심을 기울이고 있으며, 국내 바이오 에너지 산업의 국제 경쟁력 확보 및 산업화를 위해서는 새로운 바이오 화합물 생산 기술력을 위한 연구가 중요하다. 지속 사용 가능한 바이오매스인 미생물을 이용한 산업물질 생산은 환경적 그리고 경제적으로 많이 유용하다. 미생물에서 생산되는 지방산은 바이오 연료 (바이오 디젤)의 원료뿐만 아니라 화장품, 의약품의 원료로 고부가가치의 산업에 이용될 수 있다. 미생물에서 생산 되어지는 바이오디젤 (fatty acid methyl ester, FAME)은 친환경적이며 경제적으로도 유용하다. 이 연구에서의 목적은 대사공학 기술을 이용하여 바이오디젤의 원료인 지방산을 생산할 수 있는 고생산성 균주를 개발하는 것이다. 성장력이 좋은 대장균을 이용하여 지방산 생합성 대사경로의 초기, 신장, 종결단계에 관여하는 효소들을 암호화하는 유전자들을 순차적으로 재조합하여 여러 유전자들이 동시에 발현되었을 때 지방산 생산증진 및 구성에 미치는 영향을 조사하고, 총 지방산 (TFAs) 뿐만 아니라 지질로부터 추출되어진 유리지방산 (FFAs)의 함량도 측정하였다. 지방산 생합성 초기단계 경로에 관계된 ACC와 fabD, fabH 유전자들을 대장균에서 모두 과발현을 유도하여 야생종의 대장균에 비해 5가지의 유전자 (accA, accB, accC, fabD 및 fabH의 유전자)가 삽입된 재조합체에서 지질의 함량이 증진되었고 지방산 중 헥사데카노익 엑시드 (hexadecanoic acid, C16)의 경우 약 4.8 배가 높아진 생산성을 얻을 수 있었다. 지방산 생합성 경로의 신장 단계 (Elongation Cycle)에 관여된 유전자들 (fabH, fabG, fabZ, fabI)을 순차적으로 도입하여 과발현을 시도하였으며, 계속적으로 반복되어지는 cycle에서 각각의 유전자들이 함께 과발현 되었을 때 지방산 생산과 구성에 주는 영향을 확인하였다. 불포화지방산 함량이 야생종 대장균에 비해 약 20 배가 증가됨을 확인하였다. 포화지방산과 불포화지방산의 비율은 바이오연료의 질을 결정하는 중요한 요소이다. 불포화지방산의 증가는 바이오디젤과 jet연료와 같은 바이오연료로 사용될 있는 가능성을 높여주었다. 또한 재조합 대장균에서 NAD+/NADH ratios 변화로 발현이 잘 이루어지고 있음을 확인하였다. 마지막으로, 종결단계의 Thioesterase 유전자를 도입하여 유리 지방산의 함량을 증가시키기 위해 외래종의 유전자를 대장균에 코돈 최적화하고, 지방산이 분해되는 과정에 관계된 유전자를 제거해 주었다. 코돈 최적화 유전자 (OPSpTE, OPLlTE, OPEfTE and OPBcTE)의 도입으로 짧은 지방산 (C8-C14)들이 약 3-5배 증가 되었으며 불포화지방산 (C18:1, C18:2)은 약 8-42배 증진되었다. 또한 탄소원 (산업용 crude glycerol과molasses)과 질소원을 배지조건을 최적화하였다. 대사공학적으로 재조합된 대장균은 친환경적이며 경제적으로 지방산을 생산하여 바이오연료 (바이오디젤)로 사용될 것을 예상할 수 있다.

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