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Optimization of Human Insulin Purification Process for Mass Production by Recombinant Escherichia coli

  • 민철기 (바이오융합기술협동과정)

초록/요약 도움말

For an effective mass production of human insulin by using recombinant Escherichia.coli (E.coli), insulin purification process has been optimized by finding key factors at each step of the purification process and investigating their effects on the purification process. Since the mass production of recombinant insulin was made possible, much time and effort has been spent on the development of the recombinant strain with high expression rate and the optimization of the purification process conditions for its economical production. Purification process for the recombinant insulin can be varied depending on whether E.coli or yeast is used as a host cell. This is also the case when the same E.coli is used on commercial scale, depending on each company’s production size and the developed purification process. In this research E.coli has been used as a host cell and in order to purify it, sulfonation, refolding, enzyme reaction and crystallization were applied in regular sequence. The main host cell with the highest expression rate was selected by expressing five strains that have different expression vectors. Thereafter the purification process was optimized by controlling the key factor of each purification step. In addition, after selection of two strains with contrasting expression trends out of those five strains, a method for the suppression of impurity was presented accompanied by understanding and identifying the impurity appearing during purification process. In chapter I, the influence of different leader peptides to increase expression ratio was investigated. For this, five new expression vectors (pPT-B5Kpi, pPT-T10Rpi, pPT-T13Rpi, pPT-H27Rpi, pPT-B5Rpi) which have different sizes and structure of leader peptide were constructed for the production of recombinant human insulin. And these vectors were compared based on their expression level, yields of S-sulfonated preproinsulin (SSPPI) and refolded proinsulin (RPI) and enzymatic insulin conversion rate. Finally, a new strain, H27R, with 30 % increased productivity was developed. In chapter Ⅱ, the experiment was conducted with the aim of optimization the sulfonation reaction, which is the first step in the insulin purification process after inclusion body (IB) washing. In order to optimize this step, the minimum amount of tetrathionate, an expensive catalyst, availability of alternative catalyst, pH, and temperature were investigated. In chapter Ⅲ, experiments were conducted to optimize the refolding process, a process required for protein activity during recombinant protein production when using E. coli. The affects of ß-mercaptoethanol concentration and the reaction temperatures were investigated, as they have a strong influence on the refolding yield. The optimal precipitation pH for removing misfolded proteins or impurities, after the refolding reaction was also investigated. In chapter Ⅳ, several factors such as amount of enzyme and temperature which have an affect on enzymatic reactions were investigated in order to optimize the enzymatic reaction that converts proinsulin to insulin. Especially, the optimal reaction condition was selected for increasing the conversion yield, shortening the reaction time and minimizing desthreonine human insulin (DesT-HI), as a by-product. In chapter V, purification and identification of insulin related compounds (IRCs) were conducted using B5K and H27R strain which have clearly contrasting characteristics among the five strains mentioned in Chapter I. Suppression method was proposed by investigating the main cause of production of these IRCs. In the final chapter (Chapter VI), some factors and their influence on the insulin crystallization process-the last step of the insulin purification process, are investigated. The factors affecting crystallization are diverse: pH, insulin concentration, zinc ion concentration, the amount of NaCI, acetronitrile concentration, type of buffer and so forth. In this experiment, the amount of NaCI was fixed and insulin concentration, zinc ion concentration and acetonitrile concentration were balanced to find out optimal crystallization condition.

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초록/요약 도움말

재조합 대장균을 이용한 인간 인슐린의 효과적인 대량 생산을 위하여 각 정제 공정 단계의 핵심 인자를 파악하였으며 또한 그러한 인자들이 정제 공정에 미치는 영향을 조사하여 인슐린 정제공정을 최적화 하였다. 재조합 인슐린의 대량 생산이 가능해진 이후로 발현율이 높은 재조합 균주의 개발, 각 정제공정 조건의 최적화 등을 통하여 이를 경제적으로 생산하고자 하는 많은 노력이 이루어지고 있다. 재조합 인슐린의 정제공정은 숙주로서 대장균을 사용하는가 혹은 효모를 사용하는 가에 따라서 크게 달라지며 같은 대장균을 숙주로 사용할 지라도 각 회사의 생산규모 및 개발된 정제방법에 따라 크게 달라질 수 있다. 본 연구에서는 대장균을 숙주로서 사용하였으며 이를 정제하기 위하여 설폰화, 리폴딩, 효소반응, 크리스탈화의 방법을 적용하였다. 실험에 사용된 숙주는 다섯가지의 각기 다른 발현벡터를 이용하여 단백질을 발현시켜 최대의 발현율을 나타내는 균주를 사용하였으며 이후의 각 정제공정에 미치는 핵심 인자를 조절하여 정제공정을 최적화 하였다. 또한 상기 5개의 균주에서 발현 양상이 대조적인 두개의 균주를 선정하여 정제 공정 중 혹은 정제 후 나타나는 불순물들을 파악하고 동정하여 그 생성 억제 방안을 제시하였다. Ⅰ장에서는 인슐린 발현시 발현율을 높이기 위해서 사용되는 여러가지 선도 펩타이드(leader peptide)의 효과가 연구되었다. 이 실험을 위하여 선도 펩타이드의 길이와 종류가 각기 다른 5개의 발현 벡터(pPT-B5Kpi, pPT-T10Rpi, pPT-T13Rpi, pPT-H27Rpi, pPT-B5Rpi)를 사용하여 단백질을 발현시켰으며 발효 후 발현율, 설폰화 수율, 리폴딩 수율, 효소반응 수율 등을 비교하여 생산성이 30% 좋은 H27R균주를 개발하였다. 제 Ⅱ장에서는 봉입체 (inclusion body)의 세척 후 인슐린 정제공정의 시작 단계인 설폰화 반응 조건을 최적화하기 위한 실험이 진행되었다. 이를 위하여 고가의 시약인 테트라띠오네이트의 최소 첨가량, 대체 촉매의 가용성 여부, 반응 pH 및 온도 등을 최적화 하였다. 제 Ⅲ장에서는 대장균을 이용한 재조합 단백질의 생산에 있어서 단백질 활성을 위한 필수 공정인 리폴딩 공정의 최적화를 위한 연구가 진행되었다. 이를 위하여 리폴딩 수율에 영향을 주는 베타머캅토에탄올 (ß-mercaptoethanol)의 첨가량과 반응온도 그리고 리폴딩 완료 후 잘못 리폴딩된 단백질이나 불순물을 침전시키기 위한 최적 pH가 조사되었다. 제 Ⅳ장에서는 프로인슐린을 인슐린으로 전환하는 공정인 효소반응 조건을 최적화 시키기 위하여 효소 첨가량, 온도 등 이 반응에 영향을 미치는 여러 인자를 조합, 실험하여 각 인자가 반응에 미치는 영향이 조사되었으며 특히 인슐린으로 전환수율의 증가, 반응시간의 단축, 부산물인 데스트레오닌 인슐린(desthreonine insulin)의 생성을 최소화하기 위한 최적 조건이 선별되었다. 제 Ⅴ장에서는 제 Ⅰ장에서 만들어진 다섯개의 균주 중 발현 및 정제 과정에서 특성이 분명히 대비되는 B5K 균주와 H27R 균주를 이용하여 인슐린의 발현 및 정제 후에 나타나는 인슐린 유사체를 정제, 동정하였으며 이러한 유사체들의 생성원인을 규명, 생성억제 방안을 제시하였다. 마지막 장에서는 인슐린 정제의 마지막 단계인 인슐린 결정화 공정에 미치는 인자와 그 영향을 조사하였다. 인슐린 결정화에 영향을 미치는 인자는 pH, 인슐린농도, 아연이온 농도, NaCl의 첨가량, 아세토나이트릴(acetonitrile) 농도, 버터 등 다양하나 본 연구에서는 NaCl 첨가 농도를 고정하고 인슐린 농도와 아연 첨가농도 그리고 아세토나이트릴 농도를 조절함으로서 최적화된 인슐린 결정화 조건을 최적화하였다.

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