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Application to metabolic control analysis and evaluation of metabolic flux analysis via intracellular metabolites quantification

초록/요약

분자생물학의 발전으로 대사 경로 변형을 위한 새로운 기술이 도입되어 유전자 재조합이 용이하게 되었다. 따라서 대사 경로의 특정 효소 반응을 조절할 수 있게 되어 대사 경로를 의도대로 변형할 수 있게 되었다. 이러한 응용 기술은 다양한 공학적 기술들로 정의되었다. 그 중 대표적인 기술이 대사공학이다. 대사 공학은 세포의 대사활동을 개선하여 산업적으로 응용이 가능하도록 세포 대사 네트워크 분석, 유전자 조작을 통한 우수 형질 개체 설계, 산업적인 바이오 화합물 및 바이오 에너지 생산 효율증대 등을 주요 목표로 하고 있다. 초기의 대사공학은 원하는 대사산물의 생산에 관련된 몇 가지 대사회로를 차례로 증폭 및 억제한 후에 그 결과를 지켜보는 방식이었다. 이러한 방법의 시도는 원하는 물질들의 과량 및 대량생산이 일부 가능하게 하는 반면, 새로운 유전자의 도입으로 인한 균주의 성장능력저하, 부산물의 과량생산 등의 예상치 못한 부작용도 발생시켰다. 대사흐름의 조작 및 대사회로도입을 위한 재조합 유전자기술은 많은 발전이 이루어진 반면, 대사흐름의 분석 및 예측기술은 거의 연구되지 않았던 것이다. 복잡한 대사경로를 통해 생산되는 특정물질의 생산 네트워크에서는 예측할 수 없던 상황들의 발생으로 대사공학적으로 개량된 균주가 사용되지 못하는 경우도 발생하고 있다. 따라서 대사흐름분석(metabolic flux analysis) 및 대사조절분석(metabolic control analysis) 기술의 발전이 중요성이 커졌다. 대사흐름분석은 미생물의 대사흐름의 상태를 정량적으로 분석하는 기술이며, 분석된 대사회로 흐름을 바탕으로 균주의 생리학적 상태를 정확히 파악하고 대사회로상의 핵심적인 반응을 밝혀낼 수 있다. 따라서 대사흐름분석을 통하여 새로운 유전자 도입 후 발생한 문제점 및 부작용의 원인을 밝혀낼 수 있고 이를 토대로 발생한 문제를 효율적이고 근본적인 방법으로 해결하는 것이 가능하다. 또한 대사네트워크상의 각 대사흐름, 효소, 대사물질농도의 상관관계를 분석하는 기술인 대사조절분석 기술을 사용할 경우, 전체 대사흐름을 조절하는 핵심적인 특정 대사흐름 및 효소를 파악할 수 있으며 매우 정확하게 대사흐름의 변화를 예측할 수 있다. 본 연구는 세포내대사물질 추출 방법과 정량적 분석방법을 연구하였으며 대상균주의 대사흐름분석 및 대사조절분석에 활용하였다. Escherichia coli 회분식 배양의 생장상태 중 대수기와 정지기 상의 세포내대사물질의 정량적 분석을 위한 샘플링 및 추출방법을 연구하였으며 LC-MS/MS의 SRM modes를 통한 분석을 시행하였다. 이러한 E. coli의 세포내대사물질의 정량적 분석을 위한 샘플링 및 추출방법 연구를 바탕으로 연속식 배양의 동역학 (글루코오즈 외부 섭동) 실험에서의 세포내대사물질의 정량결과를 이용하여 구축된 동역학 모델의 실제적 파라미터 추정 및 대사조절분석을 시행하였다. 연구를 산업적 가치가 있는 생산물질의 생산대사네트워크에 적용하기 위해 Klebsiella oxytoca를 대상균주로 활용, 세포내대사물질 추출방법을 확정하기 위한 실험을 진행하였다. UPLC/Q-TOF-MS를 이용한 세포내대사물질 정량분석으로 세포내대사물질 추출방법 6가지를 평가하였다. 확정된 세포내대사물질 추출 및 정량분석법을 이용하여 대상균주의 대사흐름분석결과에서의 평가에 사용하였다. K. oxytoca의 연속식 배양상 세가지 희석속도(0.1, 0.2, 0.3 h-1)에서 2,3-부탄디올 생산흐름에 변화를 줄 수 있는 pH(pH5.5 와 pH 7.0)에 대한 대사흐름분석을 시행하였다. 확정된 K. oxytoca의 세포내대사물질 추출 및 정량분석법을 이용하여 2,3-부탄디올 생산대사네트워크의 대사흐름분석에 대한평가를 수행하였다.

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초록/요약

Metabolic engineering is the modification of metabolic pathways used to improve biological system networks for diverse industrial applications, and gene recombination technology is the most commonly used technique for this purpose. New techniques of gene recombination for modifying metabolic pathways have become useful due to the advances of molecular biology. Consequently, specific enzymatic reactions can be manipulated based on metabolic pathways as designed. Such application of technology can be defined as various engineering and one major example is metabolic engineering. By improving cellular metabolism, metabolic engineering allows industrial applications for metabolic network analysis, optimal strain design via gene manipulations and it increases productivities of biofeedstock and bioenergy. Early metabolic engineering was ‘trial and error’ based; results were achieved merely by over-expressing and knocking out enzymatic reactions that were involved in metabolic production network. Although this type of approach enabled over-production of target material, it also yielded unexpected results such as over-production of by-products and slowed growth rates in some strains due to insertion of new genes. As to much development of gene recombination for metabolic flux engineering and techniques for introduction of metabolic pathway, analysis of metabolic flux and metabolic network modeling have not yet been researched in depth. In networks of products which are produced from complex metabolic pathways, application of the technology is limited as metabolic engineered strains cannot be used. Therefore, developing techniques of metabolic flux analysis and metabolic control analysis is ever more important. Metabolic flux analysis is an analysis technique used to quantify metabolic flux of microorganisms. This technique can be used to determine the physiological states of the strain of interest and detect key reactions in its metabolic network based on analyzed flux. This allows detection of problems which caused by inserted genes, ultimately which, in turn, can be solved in an effective way. Metabolic control analysis, a technique used to analyze correlations among each metabolic flux, enzyme and metabolite concentrations can be used to accurately detect changes in metabolic flux and specific key metabolic regulation factors (flux, enzyme and metabolites) can be determined. In this research, intracellular metabolite extraction and quantification method were studied, and the application of metabolic flux analysis and metabolic network analysis were discussed. First, in order to observe intracellular metabolite changes in the exponential and stationary phases of Escherichia coli batch culture, samples were taken throughout the experiment processes, and the selected reaction monitoring (SRM) modes of liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis were conducted. Moreover, intracellular metabolites from steady-state were also analyzed by performing continuous cultures of E. coli. Data were then applied to enzyme kinetic modeling and parameter estimations. To determine the best method for intracellular metabolite quantification, different quenching and extraction methods were performed. Secondly, for industrially valuable bio-chemical production, continuous culture experiments with respect to Klebsiella oxytoca were also performed and intracellular metabolites were analyzed. Taking advantage of ultra-performance liquid chromatography/ quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC/Q-TOF-MS), intra-cellular metabolites extracted by six different extraction methods were quantified. Furthermore, after finding out the best quenching and extraction method, experimental data of the utilized strains were applied to metabolic flux analysis. For K. oxytoca, the continuous cultures under different pH (pH 5.5 and pH 7.0) and different dilution rates (0.1, 0.2, 0.3 h-1) were carried out to study the 2,3-butanediol (2,3-BDO) synthesis mechanisms. Meanwhile, metabolic flux analysis (MFA) was performed based on concentration of extracellular and intracellular metabolite analysis data to get insight into the 2,3-BDO synthesis mechanisms.

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