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Light-Activated Proton Pumping Rhodopsins in Photosynthetic Microbes

빛을 이용해서 수소 이온을 펌핑하는 광합성 미생물 로돕신

  • 최아름 (Choi, Ah Reum, 생명과학과 단백질 생화학 전공)

초록/요약

A gene encoding a homologue of type I rhodopsin was found in the genome of a unicellular cyanobacterium, Gloeobacter violaceus PCC7421 (www.kazusa.or.jp), which is believed to be primitive because of the lack of thylakoids and peculiar morphology of phycobilisomes. Amino acid sequence comparison of GR with other type I rhodopsins shows several conserved residues important for retinal binding and H+ pumping. The gene was functionally expressed in Escherichia coli and bound all-trans retinal to form a pigment. In order to prove the functional activity in the cell, pumping activity was measured in the sphaeroplast membranes of E. coli and one of Gloeobacter whole cell. The efficient proton pumping and rapid photocycle of GR strongly suggests that Gloeobacter rhodopsin functions as a proton pump in its natural environment, probably compensating the shortage of energy generated by chlorophyll-based photosynthesis without thylakoids. A gene encoding a homologue of type I microbial rhodopsin was found in the genome of a marine non-motile dinoflagellate, Pyrocystis lunula. The Pyrocystis rhodopsin (PyR) gene encodes a polypeptide of 262 amino acids, with a molecular weight of 29 kDa. Surprisingly, there is no intron even though it is eukaryotic gene. Amino acid sequence comparison of PyR with other type I rhodopsins shows several conserved residues important for retinal binding and H+ pumping in the pumping opsin families. The gene was functionally expressed in Escherichia coli and bound all-trans retinal to form a pigment (λmax=513 nm at pH 7). It showed a light-driven proton pumping activity similar to Proteorhodopsin. Messenger RNA levels of PyR in P. lunula cell depended on the duration of the green light adaptation. Indirect immunofluorescence in P. lunula cell showed a marked labeling of the plasma membrane. Proteorhodopsin (PR) is a light-driven proton pump that has been found in a variety of marine bacteria. Recently, many PR-like genes were found in non-marine environments. We isolated partial genes of PR homologues using polymerase chain reaction (PCR) from the surface of the Ganges River. In order to characterize the proteins, we constructed the cassette based on GRP sequence without helices C to F and inserted the islogated conserved partial sequences. When expressed in E. coli, we could observe light-driven proton pumping activity similar to proteorhodopsin, however, photocyce kinetics of CFR(Chimeric Fresh water Rhodopsin)s are much slower than proteorhodopsin. In this paper, novel microbial rhodopsins in Gloeobacter violaceus and Pyrocystis lunula were found and characterized in photo-physical and photo-biological methods. Also new experimental technique (= chimeric rhodopsin construction) was successfully performed to characterize rhodopsin which hard to get full genome.

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초록/요약

미생물 지놈 시퀀싱 결과, Gloeobacter violacues PCC7421에서 미생물 로돕신의 유전자와 상동성이 높은 유전자, GR (Gloeobacter rhodopsin)가 발견되었다 (www.kazusa.or.jp). 틸라코이드가 없고, 간단한 형태의 색소단백질체를 가지는 G. violaceus은 원시적인 광합성세균이라고 믿어 진다. GR과 미생물 로돕신들 간의 아미노산 서열을 비교해 보면, 레티날과 결합하는 잔기와 수소 펌핑 로돕신의 수소 펌핑에 중요한 잔기가 서로 잘 보존되어 있는 것을 확인할 수 있다. Escherichia coli에서 발현된 Gloeobacter 옵신은 발색단인 all-trans 레티날과 결합해서 프로티오로돕신과 같이 빛에 의한 수소 펌핑 움직임과 빠른 광순환을 보였다. GR의 효율적인 수소 펌핑 능력과 빠른 광순환은 GR이 자연 환경에서 수소 펌핑 역할을 한다는 것을 뒷받침한다. Gloeobacter 생물체 내에서 로돕신 단백질의 역할을 증명하기 위해서, Gloeobacter를 스패로플라스트화로 만들어서, 수소 펌핑 움직임을 측정했다. 엽록소를 기초로 에너지 합성을 하는 Gloeobacter에서 GR 역시 세포의 바깥으로 수소를 이동해서 에너지를 합성 할 것이라고 추측된다. 미생물 게놈 시퀀싱 결과, 해양 쌍편모충인 Pyrocystis lunula에서 미생물 로돕신의 유전자와 상동성이 높은 유전자, PyR(Pyrocystis rhodopsin)가 발견되었다. Pyrocystis는 진핵 생물이다. 하지만, 이 유전자에는 인트론이 존재하지 않았다. PyR과 미생물 로돕신들 간의 아미노산 서열을 비교해 보면, 레티날이 결합하는 아미노산 잔기와 수소 이온을 펌핑 아웃하는 로돕신들의 수소 펌핑에 중요한 아미노산 잔기가 서로 잘 보존되어 있는 것을 확인할 수 있다. E. coli에서 발현된 Pyrocystis 옵신은 발색단인 all-trans 레티날과 결합해서 pH 7에서 513 nm의 최대 흡수 파장을 가졌다. 이 단백질 역시 빛을 받으면 수소 이온을 펌핑 아웃하는 성질을 가졌다. PyR mRNA 양은 P. lunula가 녹색 빛에 노출되는 시간에 의존적으로 증가하는 현상을 확인했다. 그리고 면역 형광법을 이용해서 PyR이 세포내에서 원형질막에 존재하는 것을 확인했다. 최근에 해양 박테리아에서 환경 유전체학 결과, 로돕신이 많이 발견되고 있다. 바다뿐만 아니라 인도 갠지스강인 민물에서 미생물 로돕신 조각을 중합효소 연쇄 반응 (PCR, polymerase chain reaction)을 통해 발견했다. 실험실 내에서 옵신 조각을 전체 옵신으로 클로닝 할 수 있도록 카세트를 제작했다. 그 결과, 키메라 로돕신은 성공적으로 E. coli에서 발현되었고, 정제되어서 프로티오로돕신과 비슷한 성질을 지니고 있음을 규명되었다. 이 논문에서는 Gloeobacter, Pyrocystis에서 새로운 미생물 로돕신을 발견하여, 그 성질을 광물리적, 광생물적 방법으로 규명했고, 키메라 로돕신을 성공적으로 발현 시키고, 키메라 로돕신의 성질을 관찰했다.

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