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Erythropoietin의 당사슬 불균일성 및 시알산 함량 증가에 관한 연구

Heterogeneity of Glycoform and In vitro Sialylation for Recombinant Human Erythropoietin

초록/요약

당단백질 의약품에서의 당화 (glycosylation)는 생물학적 활성, 안정성, 면역원성 등에 영향을 미치기 때문에 당 함량, 당 구조, 당사슬의 불균일성 (heterogeneity) 등에 대한 연구는 의약품의 효능과 품질에 중요한 부분을 차지한다. 특히, 당사슬은 살아있는 생물체에서 생합성 되기 때문에 내인적으로 구조적 불균일성이 발생하며, 여러 형태의 당쇄구조 (glycoform)가 존재하게 된다. 이러한 glycoform들은 최종 제품의 생물학적 활성이나 면역원성 등에 영향을 줄 수 있기 때문에 의약품 허가신청뿐만 아니라, 제조방법 변경시에도 당구조 분석을 포함한 특성분석 자료 및 품질평가 자료로서 허가기관에 제출하여야 한다. 본 연구에서는 baculovirus 발현시스템을 이용하여 곤충세포주에서 생산한 재조합인에리스로포이에틴 (recombinant human erythropoietin ; rhEPO)의 glycoform들이 숙주세포 종류, 배양온도, 배지조성 등의 제조공정 변경에 따라 어떻게 달라지는지 확인하고자 하였다. rhEPO를 숙주세포(High-Five 및 mimic Sf-9 세포주)별로 생산한 후, 당단백질 발현 여부를 SDS-PAGE, western blot으로 확인하고, 형광표지를 이용한 glycomapping으로 당쇄구조를 확인하였다. 그 결과 High-Five 세포주에서 발현한 rhEPO는 전형적인 곤충세포에서 발현되는 M3N2F, M3N2F2 등의 당구조를 나타내었고, mimic Sf-9 세포주에서 발현한 rhEPO는 주로 A2G1FS, A2G2FS가 발현되고 소량의 M3N2F, M3N2F2이 존재하였다. 배양온도의 경우, 저온 배양시 발현율이 높았으며, 당사슬 비율에 일부 차이가 있을 뿐 전반적으로 유사한 것을 확인하였다. 배지조성은 10% FBS를 포함한 배지와 무혈청 배지를 비교한 결과, 무혈청배지에 비해 10% FBS 배지에서 높은 GU(Glucose Unit) 값의 당사슬에 변화가 있는 것을 확인하였다. 당단백질 불균일성에 대한 연구는 생산 공정관리 및 제조변경 등에 따른 비교동등성 평가에 필요하며, 당쇄구조 분석을 통해 활용될 것으로 기대한다. 만성신부전환자의 빈혈치료에 사용되는 rhEPO의 효능은 시알산 함량과 연관성이 있다고 알려져 있어, 현재 시알산 함량을 증가시켜 효능을 증가시킨 개량형 EPO가 개발․판매되고 있다. 본 연구에서는 baculovirus 발현시스템을 이용하여 N-linked glycan 말단에 시알산을 붙여주는 당전이효소 sialyltransferase을 곤충세포주에서 생산할 수 있도록 baculovirus 발현시스템을 구축하고, 이로부터 발현․정제한 sialyltransferase (rhST3GalIV)를 이용하여, CHO 세포주로부터 생산한 rhEPO에 in vitro sialyation 반응을 통해 EPO의 시알산 함량을 증가시키고자 하였다. in vitro sialylation 반응 조건을 확립한 후 Lectin blot, IEF-western blotting, capillary zone electrophoresis 방법을 이용하여 in vitro sialylation 반응 후 rhEPO의 시알산 함량의 증가와 시알산이 추가되어 낮은 pI값을 가지는 highly sialylated rhEPO를 확인하였다. 이는 곤충세포주에서 발현시킨 rhST3GalIV을 이용하여 rhEPO에 in vitro sialylation하여 시알산 함량을 증가시킴으로써 기존 개량형 EPO보다 낮은 개발비용 및 생산단가로 높은 생물활성의 rhEPO 생산할 수 있어, 당단백질의약품 제품 개발연구에 도움이 될 것으로 사료된다.

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초록/요약

In the manufacture of glycoprotein drug products, glycosylation affect the biological activity, stability and immunogenicity. Therefore, studies on sugar content, sugar structure and heterogeneity of sugar chains are very important in understanding the efficacy and quality of glycoprotein drug products. Sugar chains are biosynthesized in living organisms and structural heterogeneity occurs to form the presence of various glycoproteins. Since such glycoforms may affect the biological activity or immunogenicity of final drug products, it is necessary to provide drug application data and information on physico-chemical characterization including analysis of sugar structure and quality evaluation to the regulatory authority in initial drug product applications as well as amendment applications for changes in manufacturing process. This study is to investigate how glycoforms of recombinant human erythropoietin (rhEPO) produced in insect cell lines using baculovirus expression system would be affected by different production conditions such as types of insect cells, culture temperature levels, and media composition. rhEPO was produced in two cell lines (High-Five and mimic Sf-9) and the expression of glycoproteins was verified by SDS-PAGE and western blotting. In addition, the glycomapping using the fluorescent marker was carried out to identify the structure of sugar chains. rhEPO produced in High-Five cell line showed the sugar structures of M3N2F and M3N2F2 usually expressed in typical insect cells. In mimic Sf-9 cell line, sugar structures mainly found in rhEPO were A2G1FS and A2G2FS. Small percentages of M3N2F and M3N2F2 structures were also observed. Higher expression was found when cultured at lower temperature and most rhEPOs showed similar characteristics except some differences in ratio of sugar chains. rhEPO produced in 10% FBS-containing medium showed higher GU value, compared to rhEPO produced in serum-free medium. rhEPO used in treatment of anemia in patients with chronic renal disorders is a representative recombinant glycoprotein drug product produced in CHO cells. It is known that effectiveness of EPO is related to content of sialic acid. Therefore, improved EPO products with increased content of sialic acid are under development. In this study, baculovirus expression system was developed to allow production of sialyltransferase in insect cell line. The sialyltransferase adds sialic acids to the N-linked glycan terminal. Using such baculovirus expression system, recombinant sialyltransferase (rhST3GaIIV) was obtained and used in inducing in vitro sialylation of rhEPO produced in CHO cells to increase the sialic acid content of EPO. After optimization of conditions for in vitro sialylation, Lectin blotting, IEF-western blotting, and capillary zone electrophoresis were carried out to verify if sialic acid content of EPO was increased after in vitro sialylation and if such reaction resulted in highly sialylated rhEPO with low pI value. In conclusion, the sialic acid content of EPO was successfully increased through in vitro sialylation with use of rhST3GaIIV expressed in insect host cell, allowing production of rhEPO with a higher biological activity at lower costs of development and production, compared to existing EPO products. It is considered that outcomes from this study may be useful in investigating and developing glycoprotein drug products.

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