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RNA-dependent RNA polymerase and VPg nucleotidylylation activities of murine norovirus-1 3Dpol

  • 한강록 (서강대학교 생명과학과)

초록/요약

노로바이러스는 사람에게 급성 장염을 일으키는 원인체 중 하나로 전 세계적으로 발생되는 비세균성 장염 중 가장 높은 비율을 차지하고 있다. 하지만 사람 노로바이러스는 아직까지 동물 세포주에서 배양되지 않고 실험동물 모델이 없어 바이러스의 복제와 감염성은 아직 잘 알려져 있지 않다. Murine norovirus-1 (MNV-1)은 생쥐에 감염되어 질병을 일으키는 바이러스로 최근 동물 세포주에서의 배양이 가능해져 노로바이러스 연구에 대한 모델로 많이 사용되고 있다. 본 연구에서는 MNV-1의 3Dpol과 VPg의 생화학적 특성을 알아보았다. 먼저 3Dpol을 대장균에서 발현하고 정제하여 활성을 알아본 결과 poly(A) RNA를 주형으로 하고 Mn2+ 존재 하에서 RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) 활성이 있는 것으로 확인되었다. RdRp 활성은 pH 7.4와 37▲C, 2.5 mM MnCl2에서 가장 높았으며 NaCl 처리는 3Dpol의 RdRp 활성을 억제시켰다. 3Dpol 활성 부위를 확인했을 때 245, 346, 347번째 Asp를 Ala으로 치환된 돌연변이에서 거의 활성이 나타나지 않아 이 부위가 활성에 중요함을 확인하였다. 각기 다른 homopolymeric RNA를 주형으로 하고 시발체의 유무에 따라 활성을 비교했을 때는 poly(C) RNA template에 poly(G)를 결합하는 활성이 가장 높았고 poly(G) template에는 거의 반응이 일어나지 않았으며 poly(A) template에 대해서는 oligo(U) 시발체가 반응을 촉진시키는 것으로 나타났다. 반면에 heteropolymeric RNA인 MNV-1 subgenomic RNA (sgRNA)를 주형으로 했을 때는 Mn2+의 첨가는 상보적인 RNA 합성을 일으키지 못하나 Mg2+에 의해 반대 가닥 RNA가 합성됨을 확인하였다. 마지막으로 subgenomic RNA를 주형으로 했을 때 VPg가 3Dpol의 RdRp 활성을 촉진함을 알 수 있었다. 또한 norovirus genomic RNA의 5▽ 말단에 결합되어 있는 것으로 알려진 VPg의 활성을 확인하기 위하여 마찬가지로 대장균에서 대량 발현하여 정제하고 그 기능을 살펴보았다. VPg는 다른 calicivirus와 마찬가지로 3Dpol에 의해 nucleotidylylation되며 ATP, CTP, UTP에 비해 GTP를 결합하는 활성이 더 강했다. VPg nucleotidylylation의 최적 활성은 30▲C, 1 mM MnCl2로 나타났고 MgCl2는 영향을 주지 않았다. Nucleotidylylation에 이용되는 VPg의 아미노산을 확인하기 위해 돌연변이를 제작하였다. Tyr을 Phe으로 치환한 돌연변이 실험에서 117번째 Tyr이 중요하다는 것을 확인하였고, N-말단 돌연변이를 통해 이 부위의 양전하를 띄는 아미노산들이 필수적임을 확인하였다. 마지막으로 MNV-1이 CRE와 같은 염기서열을 가지고 있는지 확인하기 위해서 positive와 negative strand RNA를 VPg nucleotidylylation 실험에 사용하였다. 실험 결과 MNV-1의 negative strand RNA가 VPg guanylylation을 촉진시키고 특히 ORF3와 3’UTR 부위에 존재하는 세개의 stem-loop 구조가 필수적임을 알 수 있었다.

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초록/요약

Norovirus is a gastroenteritis-causing agent and a major cause of nonbacterial acute gastroenteritis worldwide. Due to the lack of an efficient cell culture system and animal model to study virus propagation, the molecular mechanisms of human norovirus (HuNV) replication and its pathogenetic properties remain poorly understood. Murine norovirus-1 (MNV-1) is a mouse pathogen and has been adapted to grow in cell culture. As a result, MNV-1 serves as a surrogate model system for norovirus research. In this study, I investigated the biochemical properties of MNV-1 3Dpol and VPg. I expressed and purified 3Dpol in Escherichia coli. MNV-1 3Dpol exhibited RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) activity with poly(A) RNA template in the presence of Mn2+. The activity exhibited was greatest at pH 7.4, 37▲C, and 2.5 mM MnCl2; NaCl inhibited RdRp activity. When aspartic acid residues at positions 245, 346, and 347 were replaced with alanine, RdRp activity was almost completely abolished, indicating that these residues are essential. When 4 different homopolymeric RNAs served as templates, the activity of poly(G) synthesis on poly(C) RNA template was greatest, while no activity was observed when poly(G) was used. Furthermore, oligo(U) primer enhanced RNA synthesis with a poly(A) template. With the heteropolymeric subgenomic RNA (sgRNA) template, complementary-strand RNA was not synthesized in the presence of Mn2+, while the addition of Mg2+ produced double-stranded RNA product. Finally, VPg enhanced the RdRp activity of 3Dpol with a subgenomic RNA template. To characterize the activity of VPg, which is covalently linked to 5’ end of norovirus genomic RNA, I also expressed and purified VPg in E. coli. Similar to other caliciviruses, VPg was nucleotidylylated by 3Dpol and showed greater activity with GTP than with ATP, CTP, or UTP. The optimum conditions for VPg guanylylation were 30▲C and 1 mM MnCl2; however, no activity was observed with MgCl2. To investigate the amino acids essential for VPg guanylylation, I produced a number of mutant VPgs. The Tyr117 and basic amino acids at the N-terminus are important for nucleotidylylation by tyrosine for conversion to alanine substitution mutants and N-terminal？Cdeletion mutants. Finally, I used positive- and negative-strand MNV-1 RNAs to determine whether MNV-1 possesses a CRE-like sequence for VPg guanylylation. Negative-strand RNA enhanced VPg guanylylation; in addition, 3 stem and loop structures within ORF3 through the 3▽ UTR region are important.

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