Characterization of Microbial Rhodopsin Homologues from Marine Bacteria
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 정광환
- 발행년도 2012
- 학위수여년월 2012. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000047182
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작원 보호를 받습니다.
초록/요약
Microbial rhodopsin is a seven transmembrane helix protein that has a retinal as a chromophore. It absorbs light energy for ion pump, signal relay, or channel activities. Proteorhodopsins (PRs) are one of the most well-known proton pumping rhodopsins. PR is widespread rhodopsin in ocean bacterium. They divide into a green light-absorbing proteorhodopsin (GPR) and a blue light-absorbing proteorhodopsin (BPR) by what ranges they absorb most. Their difference is determined by marine environment with depth where light can pass. Halorhodopsins (HRs) are one of the light-induced electrogenic ion pumping rhodopsins, especially chloride ion pump. HRs were discovered in many haloarchaeal bacteria. I isolated a gene from a new bacterium IMCC3088 from West Sea and has one rhodopsin that supposed proteorhodopsin. I measured absorption spectra at pH 4, 7 and 10 of IMCC3088 rhodopsins in E. coli membranes and determined their pKa values. The ？？max were 566, 530, and 526 nm, respectively. Its pKa value was determined by titration of pH and they had diprotic fit with pKa values 5.3 and 7.4. Light-induced difference spectrum shows a several intermediates at 400, 510, and 587 nm. IMCC3088 rhodopsin has proton pumping activity. The pH dropped down when spheroplast with rhodopsin was illuminated. The photocycle at 520 nm was measured and it was shown two components. Major component`s rate was 2.4 msec and minor component of rhodopsin was 20.4 msec. I also identified new rhodopsin homologue in ？？-proteobacteria HIMB114. New rhodopsin was suggested halorhodopsin (PHR). I measured absorption spectra at pH 4, 7 and 10 of PHR and the ？？max were 560, 564, and 552 nm, respectively. Interestingly PHR is bleached at alkaline condition. Light-induced chloride ion pumping activity was measured indirectly using proton movement and treating CCCP was confirmed proton movement indirectly. Half of maximum capacity of PHR was shown at 9.23 mM of Cl-.
more초록/요약
미생물 로돕신은발색단으로레티날을 가지고 빛을 받아 이온 펌핑, 신호 전달, 이온 채널 등의 역할을 하는 7개의 transmembrane helix로 이루어진 단백질이다. 프로테오로돕신은 수소이온 펌핑로돕신 중 가장 잘 알려진 로돕신 중 하나이다. 프로테오로돕신은 바다 미생물에 광범위하게 퍼져 있으며 흡수하는 빛의 파장에 따라 녹색광 흡수 프로테오로돕신과청색광 흡수 프로테오로돕신으로 나뉘어진다. 이 그룹은 빛의 파장이 바다의 어느 깊이까지 전달될 수 있는지에 의해 결정된다. 할로로돕신은 염소이온을 펌핑하는 이온 펌핑로돕신 중 하나이며, 지금까지 호염고미생물에서만 발견되었다. 서해에서 로돕신을 가지고 있는 새로운 균주인 IMCC3088을 발견하였으며 이 로돕신은프로테오로돕신으로 추정되었다. 대장균을 이용하여 로돕신을 발현하였고 pH 4, 7, 10에서 각각 최대흡수파장을 측정하고 pKa를 결정하였다. 최대흡수파장은 각각 566, 530, 526 nm 였고 pKa는 5.3과 7.4에서 나타났다. 빛을 받은 로돕신과 빛을 받지 않은 로돕신과의 차이를 보고 400, 510, 587 nm에서 각각 중간체를 발견하였다. IMCC3088 로돕신에 어둠과 빛을 번갈아 주면서 수소이온을 세포막 밖으로 펌핑하는 능력을 확인하였다. 단백질의 빛에 대한 주기를 관찰하여 바닥 상태의 속도가 2.4 밀리초임을 알아내었다. 또한 알파프로테오박테리아인 HIMB114로부터새로운할로로돕신유전자를찾아내었다. pH 4, 7, 10에서 각각 최대흡수파장을 측정하여 각각 560, 564, 552 nm임을 측정하였으며 염기성 조건에서 로돕신이 활성을 잃어버리는 것을 관찰하였다. 수소이온의 이동을 측정하여 간접적으로 염소이온이 이동하는 것을 확인하였고 CCCP를 처리하여 수소이온의 이동이 염소이온의 펌핑에 따라 간접적으로 이동되는 것임을 확인하였다. 9.23 mM의 염소이온이 존재할 때 할로로돕신이 50%의 활성을 가짐을 측정하였다.
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