Nucleic Acid Lateral Flow Biosensor for Detecting Genotype of Human Papillomavirus using Goldnanoparticles
- 주제(키워드) Nucleic Acid Lateral Flow , Diagnostic Device , Genotyping
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 최정우
- 발행년도 2012
- 학위수여년월 2012. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 바이오융합기술협동과정
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000047121
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교 논문은 저작원 보호를 받습니다.
초록/요약
인유두종바이러스(Human Papillomavirus)는 자궁경부암, 피부암, 구강암, 인후두암등의 주요 원인 바이러스 알려져 있다. 인유두종바이러스와 관련된 질병의 측정 및 진단을 위해 인유두종바이러스의 유전자형을 확인하는 것은 매우 중요하다. 유전형 확인을 위해 보편적으로 사용되는 마이크로어레이인 HPVDNAChip은 검체 준비과정, 교잡반응, 세척 단계의 시간이 많이 필요 하고 결과 판독을 위해 필요한 특별한 장비 및 숙련된 기술자가 필요한 점 등의 단점이 있다. 본 논문은 이러한 제한들을 완화시키기 위해 크로마토그 래피 선을 이용하는 핵산 측면 흐름 바이오센서를 개발하여 그 효과를 증명 하는 것을 다룬다. 핵산 측면 흐름 바이오센서를 이용하면 장비나 사용자에 제한 없이 한 번에 검출 결과를 확인할 수 있다. GP5+/GP6+ 프라이머를 사용하는 PCR 방법은 인유두종바이러스의 유전형을 확인하는 기술로 매우 잘 확립되어있다. 하지만 이들 프라이머를 사용하여 유전자를 증폭했을 때, 민감도와 특이도가 낮다는 단점이 있다. 본 논문에서는 위 프라이머를 수정 하여 사용했으며, hot start taq을 함께 사용하여 실험하였다. 또한, PCR 산물들의 캐리-오버 오염을 방지하기 위하여 삼인산디옥시타이미딘 대신 디옥시우리딘삼인산염을 UDG와 함께 사용하였다. 세포주에서 표적 DNA가 추출되어 PCR 기법을 통해 증폭 되었다. 증폭된 PCR 산물은 6, 11, 16, 18형의 인유두종바이러스 각각의 유전자형의 반응 특이 도가 높은 프로브들이 고정화된 멤브레인 있는 핵산 측면흐름 바이오센서 표면에 주입된다. 표적 DNA는 금 나노입자에 연결된 올리고뉴 클레오타이드와 교잡반응 하면서 바이오센서를 따라 계속 흐르게 된다. 이후 금 나노입자와 결합된 표적 DNA의 다른 부분이 바이오센서에 미리 고정된 DNA 프로브와 교잡 반응하게 된다. 흐름이 끝나면, 육안으로 인유 두종바이러스의 유전자형을 육안으로 확인할 수 있게 된다. 핵산 측면 흐름 바이오센서의 분석적 성능을 HPVDNAChip 비교했을 때, 특이도는 비슷하 였으나, 민감도가 낮은 것을 확인할 수 있었다. 이번 실험을 통해 핵산 측면 흐름 바이오센서가 인유두종바이러스의 유전자형을 검출해낼 수 있으며, DNA를 기반으로하는 현장진단(POCT)에 효과적일 수 있다는 가능성을 나타내었다.
more초록/요약
Human papillomavirus(HPV) is known to cause a variety of human diseases such as cervical cancer, skin cancer, oral cavity cancer, and pharyngolaryngeal cancer. HPV DNA detection and genotyping are important for diagnosis and measurement of HPV-associated diseases. HPVDNAChip, a commonly used DNA microarray method, has some inconveniences, such as time consuming sample preparation, incubation, washing steps, and technical expertise as well as the requirement of specialized equipments. To circumvent this limitation, we developed and validated a nucleic acid lateral flow(NALF) biosensor; utilizing membrane strip chromatography. The NALF biosensor is a one-step visual method to detect nucleic acids, which does not require specific techniques or instrumentations. The GP5+/GP6+ PCR(polymerase chain reaction) assay is a well-established HPV detection technique, but the primers used in the amplications have weaknesses such as low specificity and sensitivity. In this paper, a modified primer set was used and the effects of incorporating hot start step into the protocol were examined. In addition, dTTP was substituted with dUTP to permit contamination control measures against carry-over PCR products. The target DNA was extracted from cells and amplified by PCR. Type specific probes for the HPV subtype 6, 11, 16, 18 were immobilized on the membrane surface of the NALF biosensor, and amplified PCR products were added. The target DNA hybridizes with oligonucleotide-funtionalized gold nanoparticles(NPs) while flowing along the biosensor, and then the DNA-gold NPs complexes hybridize to the already immobilized probe. The result was able to be determined with the naked eye. By comparing the analytical performances of the NALF biosensor with the HPVDNAChip, we can demonstrate that the NALF biosensor is equivalent specificity and less sensitivity. The sensor was used successfully in detecting HPV in human cervical samples. This indicates that oligonucleotide ？ funtionalized gold NPs probes can be effectively utilized to NALF biosensors for point-of-care test(POCT) of DNA based diagnosis.
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