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Development of Arginine Peptide Mediated Gene Delivery System and Evaluation of Potential Risk Associated with Xenotransplantation

  • 김나영 (서강대학교 생명과학과)

초록/요약

To treat diseases efficiently, new various therapies such as gene therapy, cell therapy and transplantation, are developed. The gene therapy is the insertion, alteration, or removal of genes within a cells and biological tissues to treat diseases. Cell therapy is the process of introducing new cells into a tissue in order to treat a disease. The introduced cells are stem cells that are autologous and allogeneic, mature and functional cells, modified human cells, and non-human cells. Xenotransplantation is the transplantation of living cells, tissues or organs from one species to another, such as from pigs to humans. In this study, I focused the development of efficient gene delivery system for gene therapy or cell therapy using arginine peptide delivery system and the evaluation of potential risk associated with xenotransplantaion. The development of carriers that can efficiently deliver therapeutic genes to cells and express encoded proteins is required for success of gene therapy. Efficient delivery systems are required to exploit the enormous potential of RNA interference for cancer gene therapy. I introduced an arginine peptide-based small-interference RNA (siRNA) delivery system for in vitro and in vivo RNA interference. Arginine peptides formed stable complexes with siRNA and transduced siRNA into COS-7 cells in vitro, resulting in efficient gene silencing. At 24 h after transfection, most of the siRNA signals were observed in the perinuclear region, indicating that siRNA was targeted to the perinuclear region for interactions with RNA-induced silencing complex (RISC). Effective in vivo RNA interference was achieved in a mouse model bearing a subcutaneous tumor. Intratumoral administration of HER-2-specific siRNA/peptide complexes resulted in a marked reduction of tumor growth. Body weight monitoring during treatment showed that my delivery system was nontoxic. My approach offers the potential for siRNA delivery in various in vitro and in vivo applications. The ability of human mesenchymal stem cells (hMSCs) to differentiate into specific cells holds promise for therapeutic use in cell- or gene-based therapy. Genetic modification of hMSCs by introduction of therapeutic genes is an important tool for successful cell-mediated gene therapy. Like most primary cells, hMSCs are difficult to transfect with current gene delivery methods. In the present study, I examined the use of a short arginine peptide as a carrier for DNA delivery in hMSCs. The hydrophobically modified arginine peptide, palmitic acid-R15 (PA-R15), formed a condensed complex with DNA and successfully delivered the gene into hMSCs without compromising cell survival rate. In addition, transfected cells retained their stem cell properties including the ability to differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Moreover, the erythropoietin (EPO) gene was successfully transfected into hMSCs and the cells produced EPO for 4 weeks. Hydrophobically modified arginine peptides are promising candidates with low toxicity and efficient non-viral gene delivery vectors for hMSCs and these may be used as a potential tool for basic research and the therapeutic application of hMSCs. Clinical transplantation has become one of the preferred treatments for end-stage organ failure, and one of the novel approaches being pursued to address the limited supply of human organs involves the use of organs from other species. The pig appears to be a near ideal animal due to proximity to humans, domestication, and ability to procreate. The presence of Gal-α1,3-Gal residues on the surfaces of pig cells is a major immunological obstacle to xenotransplantation. The α-gal epitope causes hyperacute rejection of pig organ in humans, and thus, the elimination of this antigen from pig tissues is highly desirable. Recently, concerns have been raised that the risk of virus transmission from such pigs may be increased due to the absence of α-gal on their viral particles. In this study, transgenic cells expressing α1,3GT were constructed and vaccinia viruses propagated in HeLa/α-gal cells also expressed α-gal on their viral envelopes and were more sensitive to inactivation by human sera than vaccinia virus propagated in HeLa cells. My data indicated that α-gal epitopes are one of the major barriers to zoonosis via xenotransmission. Upon xenotranplantaion, the endogenous retrovirus from the donor species may be transmitted to the recipient with insufficient immune functions. Three subgroups of the replication competent PERV (PERV-A, PERV-B, and PERV-C) have been identified in pigs. I constructed a molecular clone of PERV-B from a Korean domestic pig BAC clone containing PERV genomes, and its replication-competency was characterized in human cells. Using PERV-B molecular clone, I aimed to test whether the viral xenotransmission may increase in the host animals under immuneadapted viral source, and whether the immune suppression can affect the transmission to the host animals. Using mouse as a host animal model, I studied the transmission of PERV. Six weeks after transplantation of PERV-producing cells to mice, the transmission of PERV occurred in higher frequencies in the mice under cyclosporin A treatment than in the untreated mice. Moreover, the increase of PERV transmission in the organs of host animals was observed following the transplantation with murinized PERV-producing cells in comparison with porcine PERV-producing cells. The transmission of PERV in the host animals did not affect weight increases, but the immune responses. In PERV-transmitted mice, the decrease of T cell numbers was not able as compared to the mice without PERV transmission. My results suggest that the risk of PERV xenotransmission may increase especially in the hosts under immunological host adapted organ xenotransplantation, and under immuno suppressive treatment. The arginine peptide delivery system opens a new avenue for the development of an efficient and safe delivery system for therapeutic applications. To achieve xenotransplantation more safely, the attentions to the viral zoonosis are required, and to achieve the practical xenotransplantation in clinical field, we have to study about PERVs, and have to remove the PERVs from the pig’s genome. Although, my study showed the difficulties of xenotransplantation, it might be an important step to approach clinical application.

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초록/요약

질병을 치료하기 위하여 최근에 여러가지 새로운 치료 방법이 개발되고 있다. 유전자 치료를 이용하여 암을 치료하거나 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여, 세포의 생물학적 특성을 변화시켜 질병을 치료하고, 조직 또는 장기의 파손된 기능을 대체할 목적으로 장기 이식을 통하여 질병을 치료하기도 한다. 본 연구에서는 세포 내로 치료 유전자를 효과적으로 전달하는 시스템을 구축하는 것이 먼저 선행되어야 효율적인 유전자 치료가 이루어지기 때문에 이를 위한 효과적인 유전자 전달 시스템을 개발하였고, 장기 이식에서 이종 장기를 사용했을 경우 발생할 수 있는 위험성에 대하여 연구하였다. 암 유전자 치료를 위하여 최근에 RNA interference를 이용한 치료법이 개발되고있으며, 본 연구에서는 small-interference RNA (siRNA)를 아르기닌 펩타이드를 이용하여 세포내로 전달한 뒤 특정 유전자 침묵 현상을 확인하였다. 아르기닌 펩타이드와 siRNA는 복합체를 형성하고 있으며, 이러한 복합체가 세포내로 전달된 뒤, siRNA는 RNA induced silencing complex (RISC)와 상호작용할 수 있는 핵 주위에서만 위치하고 있다는 것을 확인하였다. 난소암세포를 피하로 주입하여 tumor를 유도한 누드 마우스에서 HER2 유전자를 타겟하는 siRNA를 아르기닌 펩타이드를 이용하여 암세포로 전달한 뒤 tumor의 크기가 작아졌으며, HER2 단백질이 감소하는 것을 확인하였다. 아르기닌 펩타이드와 siRNA복합체가 마우스에 주입되어도 마우스의 무게에는 변화가 없었으며, 이는 우리의 유전자 전달 시스템이 독성이 없다는 것을 의미한다. 이러한 실험 결과를 통해 아르기닌 펩타이드는 siRNA를 세포내로 전달할 수 있는 수송체임을 알수 있으며 in vivo에서도 효과적인 수용체로 사용될 수 있는 가능성을 보여주고 있다. 인간 중간엽줄기세포는 다양한 중간엽세포로 분화 가능하여 세포 치료 및 유전자 치료의 매체로서 중요한 의미를 가진다. 그러나 인간 중간엽줄기세포로의 유전자 전달이 쉽지 않기 때문에 본 연구에서는 인간 중간엽줄기세포에 효율적으로 유전자를 전달할 수 있는 수송체를 연구하였다. 팔미트산이 결합되어 있는 아르기닌 펩타이드를 이용하여 최적의 세포 내 유입 조건을 확인하였고, 세포 독성이 없다는 것을 확인하였다. 이렇게 유전자가 전달된 세포들은 지방세포와 뼈 발생 세포로의 분화가 가능하여 유전자가 전달된 후에도 분화능을 잃지 않는 것을 확인하였다. Erythropoietin (EPO)유전자를 전달한 뒤, 4주 동안 EPO가 생산되었으며 이는 전달된 유전자가 오랫동안 세포 내에서 유지되며 원하는 단백질이 발현된다는 것을 의미한다. 이러한 결과들은 팔미트산이 붙은 아르기닌 펩타이드를 이용한 전달 시스템이 유전자 치료의 매체가 되는 인간 중간엽줄기세포의 조작의 발전에 도움이 될 수 있음을 보여준다. 장기 이식 기술의 발달과 함께 이식을 필요로 하는 많은 환자에 비해 절대적으로 부족한 장기 공급문제를 해결하기위해 동물로부터 바이오 장기를 생산하여 사람에게 이식하려는 이종 간 장기 이식에 관한 연구가 전 세계적으로 활발히 진행되고 있다. 이종 장기 제공원은 장기의 크기, 번식 효율, 사육 기술, 인체 감염 가능성외에도 경제 산업적 측면 등을 고려할 때 돼지가 이종이식 장기 제공 동물로 가장 적절한 것으로 보고 되어있는데, 돼지 세포에는 사람에게는 불활성화 되어있는 당전이 효소인 α1,3galactosyltransferase (α1,3GT)로 인해 세포 표면에 Galα1-3Gal β 1-4GlcNAc-R (α-gal epitope)이 존재하게 된다. α-gal epitope은 이종 장기 이식에 있어, 사람에게 존재하는 anti-α-gal 항체에 의한 급성 면역 거부반응 (Hyperacute rejection)을 유발하게 되어 돼지를 이종간 장기 이식 제공원으로 사용하는 데 있어 문제가 된다. 최근에는 α-gal epitope을 knockout시킨 형질전환 돼지를 만들어 이러한 문제점을 해결하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있으나 α-gal epitope의 부재로 인해 돼지 유전자내에 삽입되어 있는 내인성 레트로 바이러스 (Porcine Endogenous Retroviruses, PERVs) 유전자에 의해 만들어지는 PERVs의 인간 세포로의 감염성은 높아질 가능성에 대한 연구가 보고 되었다. α-gal epitope을 가지는 사람 세포주를 건설한 뒤, α-gal epitope을 가지는 vaccinia virus를 생산하여 실제 사람의 serum에 대한 중화능을 확인한 결과, α-gal epitope을 가지는 vaccinia virus가 중화가 잘되는 것을 확인하였다. 이는 사람과 유사하도록 조작된 세포에서 생산된 바이러스는 오히려 사람에게 좀 더 감염이 잘될 수 있다는 것을 의미한다. α-gal epitope과 더불어, 돼지 장기를 이종간 장기 이식에 사용할 때 문제시 될 수 있는 PERVs를 연구하기 위하여, PERVs를 생산하는 PERV-B molecular clone을 제작하였고, PERVs 를 생산하는 재조합 세포주를 이용하여 PERVs의 체내 감염 기작을 규명하였다. 지속적으로 PERVs 가 생산되는 재조합 세포주를 cyclosporine A를 처리한 BalB/C 마우스에 이식하여, PERVs의 감염을 확인한 결과, PK15 세포에서 생산된 PERVs보다 마우스 세포에서 생산된 PERVs 가 in vivo상에서 감염능이 더 높은 것을 확인하였다. PERVs가 감염된 마우스의 혈액을 채취하여 T세포와 B세포의 수를 확인한 결과, PERVs의 감염으로 인해 T 세포가 감소한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 효과적인 이종간 장기이식을 하기 위해, 면역학적으로 host와 유사하게 조작된 세포나 장기를 이용하게 되면, 이종 세포나 장기에 대한 면역 반응은 감소하지만, 이로인해 이종 세포나 장기에서 생산되는 바이러스에 의한 zoonosis는 증가되는 위험성이 있다는 것을 의미한다. 효율적으로 질병을 치료하기 위해서 여러가지 새로운 질병 치료 방법이 개발되고 있다. 그 중에서도 유전자 재조합 DNA 기술의 발달로 인하여 과거에는 치료가 불가능했던 질병의 치료 가능성이 높아졌고, 장기 이식 기술의 발달로 이종간 장기 이식에 대한 연구가 활발해졌다. 유전자 치료의 가능성을 높이기 위해서는 독성이 없으며 유전자 전달 효과가 뛰어난 전달 시스템이 요구되며, 본 연구를 통해서 독성이 없이 siRNA나 DNA를 포유류 세포뿐만 아니라 인간 줄기 세포까지 전달이 되는 아르기닌 펩타이드 전달 시스템을 개발하였다. 아르기닌 펩타이드 전달 시스템을 사용한다면 독성이 없기 때문에 효율적으로 유전자 치료를 할수 있을 것이다. 그리고, 이종간 장기 이식을 위하여 면역학적으로 인간과 유사하게 조작된 장기를 사용한다면, 이로 인한 zoonosis의 위험성이 증가됨을 본 연구에서 확인하였고, zoonosis로 인한 새로운 질병이 초래될 수 있기 때문에 면역학적으로 조작된 이종 장기를 사용하기에 앞서 zoonosis에 대한 연구가 선행되어야 할 것이다.

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