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Screening of XHEX Partner Molecule in Developing Xenopus laevis Embryos

  • 신지윤 (생명과학과 발생학 전공)

초록/요약

HEX (Hematopoietically expressed Homeobox) 는 세포분열과 분화, 조혈 및 혈관계 형성 등 척추동물의 발생에 관련된 많은 기능을 하는 단백질이다. 이 단백질은 N-말단에 repression domain, C-말단에 acidic activation region, 그리고 DNA binding domain인 homeo domain 을 포함하고 있으며 이를 통해 유전자의 발현을 억제하거나 혹은 활성화하는 전사인자로서 작용하며, 때로는 전사 후 조절인자로 작용하기도 한다. 특히 XHEX는 간에 특이적으로 발현되는 유전자들의 발현을 조절하며, XHEX를 knock-down 시킬 경우 간 형성이 저해된다 (Lee, 2003). Wholemount in situ hybridization 실험을 통해 후기 단계 배아 (NF stage 35) 에서 XHEX 의 발현양상을 확인한 결과, XHEX 는 간 뿐만 아니라 머리와 갑상선 부분 그리고 척삭 부분에서도 발현되었다. 이는 XHEX 가 간 발생뿐 아니라 다른 조직이나 기관의 발생에도 관여되어 있음을 시사한다. 본 연구에서는 발생 후기 단계에서 XHEX 의 기능을 규명하기 위해, XHEX의 표적 유전자의 전사조절에 관여할 가능성이 있는 XHEX의 partner molecule을 찾아내고자 immunoprecipitation과 mass spectrometry를 수행하였다. St. 35 시기 배아의 머리와 배, 그리고 배아전체에서 위 실험을 수행한 결과, 각 부분에서 55 (머리), 75 (배), 232 (전체) 종의 잠재적 XHEX partner molecule들을 발견했으며, 이들을 gene ontological analysis를 기반으로 기능과 관여단계에 따라 분류하였다. 기능에 따른 분류 결과 대다수의 partner molecule들이 생물학적 조절, 세포간 상호작용, 단백질 변형, RNA 대사, 발생 등의 활동에 관여하는 것으로 정리되었고, 관여단계에 따른 분류 결과 대부분이 nucleotide binding, nucleoside binding 그리고 protein binding process에 관여하고 있음을 알 수 있었다. 좀 더 세부적인 분석을 위해 실험에서 얻어진 후보 단백질들을 세포 내 발현 위치에 따라 세분화 한 후 핵과 세포질에 존재하는 단백질들 만으로 위와 같은 분류를 수행하였다. 이 결과 후보 단백질들은 위에 언급한 기능 이외에도 chromosome organization, 그리고 DNA packaging에도 관여되어 있음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 서로 다른 실험 군에서 공통적으로 발견된 단백질만을 대상으로 한 분류에서도 나타났으며 이를 통해 XHEX가 chromosome organization 과 DNA packaging 에도 관여할 가능성이 있음을 알 수 있었다. Gene ontological analysis를 통한 기능과 과정 그리고 세포 내 위치에 따른 분류와 Xenbase를 통한 발현 장소, 발현 시기별 분류를 통해 XHEX 와 결합할 가능성이 높은 12종류의 단백질을 찾아냈으며 향후 이 단백질들과 XHEX 간의 상호작용에 대한 연구를 통해 XHEX 가 Xenopus laevis의 발생상 기능을 규명할 수 있을 것으로 기대된다.

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초록/요약

The HEX (Hematopoietically expressed Homeobox) protein is an essential transcription factor in many vertebrates developmental processes such as cell proliferation and differentiation, hematopoiesis and formation of vascular system. HEX contains the N-terminal repression domain, the C-terminal acidic activation domain and the homeobox DNA binding domain through which HEX acts as a transcriptional and a posttranscriptional regulator. Previous studies have shown that XHEX is an essential transcription factor in the liver development of Xenopus laevis. The knock down analysis of XHex transcripts using morpholinos showed that XHEX regulates several liver specific genes expression in the tail-bud Xenopus laevis embryos (Lee, 2003). I extended expression pattern analysis of XHex with stage35 Xenopus laevis embryos and found that XHEX transcripts appear not only in the liver and the thyroid, but in the brain, the pronephros and the notochord. Therefore, the identification of proteins that interact with Xenopus laevis HEX (XHEX) may contribute to understand the functional regulation of HEX which participates from the axis formation in early embryos to the organogenesis in the late stage embryos. In this context, I performed immunoprecipitation and mass spectrometry with three groups of Xenopus laevis embryos at stage 35; head region, body region and whole embryo. 327 proteins in total were identified including 55 proteins from the head region, 75 proteins from body region and 232 proteins from whole region of embryo samples. 327 potential XHEX partners were classified into function and process according to the Gene Ontological (GO) categories. The functional categories of identified proteins were mostly associated with biological regulation, cell communication, protein modification, RNA metabolic process, and development. In the process categories, the proteins were mostly associated with nucleotide binding, nucleoside binding and protein binding. Through more specified GO analysis with modified lists of potential XHEX partners, I found that XHEX might be associated with chromosome organization and DNA packaging. Among 327 proteins, 102 proteins which were exclusively localized to either nucleus or cytoplasm, act in chromosome organization and DNA packaging. Additionally, 41 proteins which were identified more than twice in different groups of embryos were also act in chromosome organization and DNA packaging. Through the GO analysis and the expression profiling with XENBASE, I narrowed 327 proteins down to 12 proteins. These proteins were expected to be genuine XHEX partners. To validate the results, I propose to examine the Xenopus promoter sequences to find out whether any Xenopus promoter sequence has binding motifs both for XHEX and the selected 12 proteins. If there is(are) such promoter sequence(s), it might be the target gene(s) coregulated by XHEX and the partner(s).

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