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Oxidation Effects on T-type Ca2+ Channels Expressed in Xenopus Oocytes

초록/요약

산화∙환원 상태의 변화는 다양한 이온 통로들의 생리학적 특성을 역동적으로 조절하는 것으로 보고되었다. 그러나 T-형 칼슘통로의 특성들이 산화∙환원에 의해 어떻게 조절되는지에 대한 연구는 부족한 상태다. 본 연구에서는 시스테인에 특이적으로 작용하는 산화제인 DTNB가 T-형 칼슘통로 Cav3.1과 Cav3.2의 전기생리학적 특성을 어떻게 변화시키는지 조사하였다. DTNB (1 mM) 처리시, 두 칼슘통로의 전류 크기가 약 50% 차단되었고, 전류의 활성화와 비활성화 키네틱스가 느려졌다. 또한, DTNB는 Cav3.1 통로의 활성화와 비활성화 곡선을 양 방향으로 이동시켰으나, Cav3.2 통로의 특성에는 유의한 변화를 일으키지 않았다. Cav3.1 통로의 활성화와 비활성화 곡선을 양 ？？향으로 이동시키는 데 기여하는 구조적 위치를 찾기 위하여, 두 T-형 통로의 키메라, GGHH와 HHGG를 제작하였다. HHGG 키메라의 활성화와 비활성화 곡선은 DTNB에 의하여 양방향으로 이동하였으나, GGHH에서는 거의 이동하지 않았는데, 이는 Cav3.1의 세 번째와 네 번째 도메인이 DTNB에 의한 양 방향 이동에 관여하는 구조적 요소를 포함하고 있음을 시사한다. 추가적인 키메라 HHGH와 HHHG를 대상으로 DTNB에 대한 반응을 조사한 결과, DTNB는 HHGH의 비활성화 곡선만 양 방향으로 이동시키고, 활성화 곡선에는 변화를 주지 못했다. 반면, HHHG에서는 활성화 곡선만이 DTNB에 의하여 양 방향 이동하였고 비활성화 곡선은 변화되지 않았다. DTNB가 작용하는 부위를 동정하기 위하여, 세 번째와 네 번째 도메인에 존재하는 시스테인들의 점 돌연변이체들을 제작하고, 이들에 대한 DTNB의 반응 실험을 추가로 수행해야 할 것이다. 본 연구는 산화∙환원에 의해 조절되는 T-형 칼슘 통로의 구조 변화를 이해하는 데 기초가 될 것으로 사료된다.

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초록/요약

Changes in reduction and oxidation (redox) states were reported to dynamically modulate biophysical properties of diverse ion channels. However, it has not been closely examined how redox modulates the properties of T-type Ca2+ channels. Oxidation effects on Cav3.1 and Cav3.2 channels were here examined by comparing their biophysical properties in the absence or presence of DTNB, an oxidizing agent. Application of 1 mM DTNB reduced current amplitude of both channels by ~50% and slowed down their activation and inactivation kinetics. In addition, DTNB positively shifted both activation and steady-state inactivation curves of Cav3.1, while it did not shift those of Cav3.2. To localize structural region(s) contributing to the positive shifts of Cav3.1, half-half chimeras (GGHH and HHGG) between the two T-type channels were constructed and their responses to DTNB were examined. The activation and inactivation curves of HHGG were positively shifted by DTNB, whereas those of GGHH were little, suggesting that the domains III and IV of Cav3.1 may contain structural elements responsible for the DTNB-mediated positive shifts. DTNB shifted the inactivation curve of HHGH without shifting its activation curve. In contrast, DTNB did not shift the inactivation curve of HHHG with positively shifting its activation curve. Additional point-mutation studies remained to localize DTNB-oxidizing cysteine residues spreading over domains III and IV of Cav3.1 channel. These findings may contribute to illustrating the structural basis of T-type calcium channels of which electrophysiological properties can be dynamically modulated depending on variable redox states.

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