Identification of in-host secreted insulin-degrading enzyme (isiA) in Vibrio vulnificus.
패혈증 비브리오균에서의 숙주 내 특이 발현성 인슐린 분해 분비 효소 (isiA)의 발견.
- 주제(키워드) Vibrio vulnificus , isiA , insulin-degrading enzyme , IDE , IVET , protease
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 김건수
- 발행년도 2009
- 학위수여년월 2009. 8
- 학위명 석사
- 학과 일반대학원 바이오융합기술협동과정
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000045531
- 본문언어 영어
- 저작권 서강대학교의 논문은 저작권에 의해 보호받습니다
초록/요약
A novel virulence factor, isiA (in host-secreted insulin-degrading enzyme A) was discovered in Vibrio vulfnicus, a causative agent of septicemia and wound infection in human. isiA was identified by two independent methods for screening of virulence factors.; the in vivo expression technology (IVET) and comparative transcriptomic microarray studies among the strains with various virulence potentialities. Taken together, this gene was expected to be expressed specifically in host and higher in virulent strains. The gene isiA had the inverzincin motif (HXXEH), a common feature of other insulin-degrading enzymes. Purified recombinant IsiA exhibited insulin-degrading activity. The gene isiA possesses N-terminal signal peptide and when overexpressed, IsiA was detected massively in supernatant, suggesting that IsiA is an extracellular protein. IsiA may directly degrade host factors such as insulin, and also chemokines by which is beneficial for the pathogenesis. In mouse model, isiA mutant displayed diminished virulence, lower level of glucose, higher level of insulin and delayed proliferation in host. Other than insulin, the degrading capability of IsiA reached to a few chemokines, which are under the size specificity of IsiA substates. Additionally, V. vulnificus turned out to harbor another insulin-degrading extracellular protease, an elastase (vvpE). Unlike isiA, vvpE is submissively regulated by quorum-sensing and the responsible substrates are non-specific. The gene isiA is expressed with isiC (quinone reductase) and isiB (hypothetical membrane protein), which are organized altogether in isi operon.
more초록/요약
Vibrio vulnificus 균은 사람에게 있어서 폐혈증과 상처감염을 일으키는데, 이 균에서 isiA (in-host secreted insulin-degrading enzyme, 숙주 내 특이적 분비성 인슐린 분해효소) 라는 병원성 유전자가 발견되었다. 이 유전자는 병원성 유전자를 찾아내는 두 가지 독립적인 방법을 통해 공통적으로 발견되었는데 그 중 하나는 숙주 안에서만 특이적으로 발현되는 유전자를 찾는 IVET (the in vivo expression technology)이라는 방법이며, 다른 하나는 다양한 출처에서 분리한, 발병능력이 다른 V. vulnificus 균주들을 대상으로 DNA 마이크로 어레이 실험을 통해 전체 전사양상을 비교함으로써 병원성이 높은 균주에서 더 높게 발현되는 유전자를 찾아내는 방법이었다. 두 방법을 통해 공통적으로 발견된 isiA는 V. vulnificus가 생체 내에서 병을 일으키는 데에 있어서 중요한 역할을 하는 유전자라 예상되었다. 유전자 isiA의 아미노산 서열을 분석한 결과, 기존에 보고된 인슐린 분해 효소에서 공통적으로 발견되는 inverzincin motif (HXXEH) 구조를 가지고 있었다. 이를 통해, IsiA는 인슐린을 분해할 수 있는 효소라고 가정하였고, 이를 시험하기 위하여 재조합 단백질로 발현시켜 정제하고, 재조합 IsiA를 인슐린과 반응시켰다. 그 결과 재조합 IsiA 단백질은 인슐린 분해 활성이 있음을 확인하였다. IsiA는 N-말단에 막 이동을 위해 필요한 signal peptide를 가지고 있으며 과발현을 시키면 세포 밖에서 많은 양이 검출되었다. 이는 IsiA가 분비 단백질의 일종이며, 분비된 IsiA는 숙주에서 존재하는 기질을 직접적으로 분해할 수 있음을 암시한다. 이를 검증하기 위해 쥐를 이용하여 생체 실험을 실행한 결과 isiA 돌연변이체는 야생형에 비해 병원성이 떨어지는 것뿐만 아니라, 쥐의 체내에서 자라는 속도도 현저히 떨어짐을 알 수 있었다. 또한, 야생형에 감염된 쥐에 비하여 isiA 돌연변이체에 감염된 쥐의 생체 내 인슐린 수준이 높은 것을 관찰 하였다. 그리고 IsiA는 인슐린 이외에 몇몇 종류의 chemokine들도 분해하는 것으로 관찰되었다. 이러한 관찰을 바탕으로, IsiA가 숙주 면역 체계로부터의 회피에 관여함으로서 V. vulnificus의 병원성에 기여를 할 수 있을 것이라고 예상한다. 추가적으로, IsiA 외에도 인슐린을 분해할 수 있는 elastase라는 분비성 효소를 찾아냈는데 이 효소는 세포밀도인식(quorum-sensing)에 의해 조절되는 비 특이성 단백질 분해효소이며, 병원성 유전자로 밝혀진바 있다. 따라서 IsiA의 역할은 세균 밀도가 낮은 초기에, 집중될 것으로 예상된다. isiA는 isiB, isiC와 한 오페론을 이루어 발현이 되며, 시험관 배양에서 초기 정체 단계 때 발현이 좀 더 높아지는 것을 확인하였다. isiA의 발현조절에 관여하는 요소가 무엇인지는 앞으로 풀어야 하는 과제이다.
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