유전자 조작에 의한 에탄올 생산 Escherichia coli 균주 개발 및 내성 강화를 위한 개량
Development of a more efficient ethanolic Escherichia coli by gene mutation and improving ethanol resistance
- 주제(키워드) zymomonas mobilis , bio-ethanol , ethanolic E. coli
- 발행기관 서강대학교 일반대학원
- 지도교수 이진원
- 발행년도 2009
- 학위수여년월 2009. 2
- 학위명 석사
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000044904
- 본문언어 한국어
초록/요약
Due to dwindling of fossil fuel, microbial production of bio-fuel from organic byproducts has acquired significance in recent years. Ethanol has been trusted as an alternate fuel for the future. The ethanologenic pathway in Z. mobilis (Zymomonas mobilis), like that of saccharomyces cerevisiae, consist of two essentail activities, pyruvate decarboxylaseand alcohol dehydrogenase (ADH). 1,2 These two activities and the enzymes of glycolysis comprise 30 to 50% of the soluble protein in Z. mobilis. By inserting Z. mobilis genes encoding pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase II in E. coli.3,4 E. coli was able to ferment sugars into ethanol. This study Z. mobilis (containing pdc and adhB genes) were used as the construction sources of genes and plasmids.5,6,7 Expression vectors carrying pdc and adhB genes were constructed by using pET-32a vectors. Ethanol productivity in E. coli strain seemed to be affected by the extent of expresstion of pdc gene along with adhB genes. By successful gene mutation we could establish a new E. coli strain which can produce ethanol efficiently. The wild-type E. coli cannot produced ethanol. So, recombination for ethanolic E. coli was investigated in this study. Also to confirm the production of ethanol, fermentation experiment of recombinant E. coli BL21was performed in aerobic conditions. 8 Also ethanol productivity was increased two fold for nitrogen source, carbon source, temperature and pH optimization.
more초록/요약
최근 몇 년간 석유 연료가 고갈이 심각해지면서 새로운 신재생 에너지인 미생물을 이용한 bio-fuel이 각광 받게 되었다. 따라서 본 연구는 미생물을 이용한 bio-ethanol의 생산에 중점을 두고자 한다. 현제 에탄올을 생산하는 균들 중에서 가장 대중화 되어있는 균주로서 대표적인 것에는 zymomonas mobilis와 saccharomyces cerevisiae가 있다. 9,10 이 중 Saccharomyces cerevisiae의 경우 박테리아 보다 안정하고 에탄올의 생산측면에서도 좋은 생산율을 보이지만 성장 시간이 길고 진핵 세포 이므로 유전자 조작 을 할 때 진행 과정상 박테리아에 비해 여러 단계를 거쳐야 하기 때문에 최종 균주로 선호 되지 않는다. zymomonas mobilis는 에탄올의 생산성 에서는 월등 하지만 saccharomyces cerevisiae처럼 성장 시간이 긴 단점이 있다. 이 단점을 극복하고자 zymomonas mobilis의 에탄올 생산 능력과 E. coli의 조작이 쉽고 균의 빠른 성장의 장점을 이용 하여 유전자 조작을 하고자 한다. 특히 zymomonas mobilis는 E, coli의 pathway상에서 Ethanol 생성에 필요한 Gene adhB (alcohol dehydrogenaseⅡ) 와 pdc (pyruvate decarboxylase)을 가지고 있으며 이를 높은 발현 레벨의 pET-32a vector에 삽입함으로서 E. coli의 glucose로부터 ethanol까지의 pathway를 연결시켰다. 그리고 호기와 혐기상태의 발효과정을 거쳐 HPLC 분석을 통해 에탄올 생산을 확인 하였다. 11 그리고 조작 균주의 에탄올 생산성을 증가시키고자 질소원 탄소원 최적화를 통하여 기존의 배지를 간소화함으로서 생산비용의 감소를 가져왔으며 에탄올에 대한 저항성을 확인한 결과 조작균주에서 에탄올에 대한 저항성의 증가를 확인 할 수 있었다. 또한 온도 최적화와 pH 최적화를 통하여 에탄올의 생산량을 2배 증진시켰다. 12,13
more목차
감사의 글 = 4
차례 = 7
그림차례 = 10
표차례 = 12
Abstract (영문) = 13
요약(한글) = 15
Ⅰ.서론 = 17
1.1 바이오 에탄올이란? = 17
1.2 바이오 에탄올의 경제성 = 18
1.3 관련 연구 동향 및 기대효과 = 21
Ⅱ.이론 = 26
2.1 세포의 생장 = 26
2.2 양론식에 의한 네트워크 모델 = 27
2.2.1 기본적인 가정 = 27
2.2.2 대사흐름 분석 = 34
2.2.3 생물학적 ethanol 생산의 대사과정 = 36
Ⅲ. 실험 재료 및 방법 = 38
3.1 균주 = 38
3.2 plasmids의 구성 = 38
3.3 배지와 배양 조건 = 46
3.4 배지 최적화 배지 및 배양 조건 = 47
3.4.1 탄소원 최적화 배지 및 배양조건 = 47
3.4.2 질소원 최적화 배지 및 배양조건 = 47
3.4.3 온도, pH 최적화 배지 및 배양조건 = 48
3.5 DNA 조작과 효모 형질전환 = 49
Ⅳ. 연구 결과 및 고찰 = 50
4.1 adhB 와 pdc를 가진 Escherichia coli 균주의 개발 = 50
4.2 호기와 혐기상태 에서의 batch fermentation 에서의 ethanol 생산 = 51
4.3 mutation E. coli BL21의 배지 최적화에 의한 ethanol 생산량 = 55
4.3.1 탄소원 최적화 실험 결과 = 55
4.3.2 질소원 최적화 실험 결과 = 59
4.4 Ethanol 독성에 의한 E. coli BL21 W. type 과 재조합 균주의 성장곡선 = 63
4.5 온도 최적화에 의한 ethanol 생산량 = 66
4.6 pH 최적화에 의한 ethanol 생산량 = 70
Ⅴ. 참고문헌 = 74
그림차례 = 10
그림1. 브라질 혼합연료 시장 점유율 추이 = 21
그림2. 세계 연료용 에탄올 VS 산업용 에탄올 = 21
그림3. 세계 바이오 연료 생산국의 생산량 = 25
그림4. 바이오 테크와 세계 바이오 에너지 토탈 = 25
그림5. Glucose로부터의ethanol 대사 네트워크 = 37
그림6. PCR product로써의 pdc 와 adhB gene의 전기영동사진 = 43
그림7. pET32a vector와 insert gene (pdc, adhB gene) in AG1 cell 확인을 위한 전기영동 사진 = 44
그림8. pET32a vector와 insert gene (pdc, adhB gene) in E. coli BL21 cell 확인을 위한 전기영동 사진 = 45
그림9. 호기상태에서의 batch fermentation 에서의 ethanol 생산 = 54
그림10. 혐기상태 서의 batch fermentation 에서의 ethanol 생산 = 54
그림11. 탄소원에 따른 cell의 성장 곡선 = 58
그림12. 질소원에 따른 cell의 성장 곡선(탄소원: glucose) = 62
그림13. 질소원에 따른 cell의 성장곡선 (탄소원: glucose +xylose) = 62
그림14. 에탄올 독성에 따른 W. type E. coli BL21의 성장 곡선 = 65
그림15. 에탄올 독성에 따른 mutant E. coli BL21의 성장 곡선 = 65
그림16. mutant E. coli BL21 의 온도 최적화 : 32°C = 68
그림17. mutant E. coli BL21 의 온도 최적화 : 37°C = 68
그림18. mutant E. coli BL21 의 온도 최적화 : 42°C = 69
그림19. mutant E. coli BL21 의 pH 최적화 : pH5 = 72
그림20. mutant E. coli BL21 의 pH 최적화 : pH6 = 72
그림21. mutant E. coli BL21 의 pH 최적화 : pH7 = 73
그림22. mutant E. coli BL21 의 pH 최적화 : pH8 = 73
표차례 12
표1. 화석연료와 바이오연료 가격 비교 = 20
표2. 주요 국가별 바이오에탄올 보급 관련 현황 = 20
표3. OECD국가의 1차 에너지 중 신재생 에너지 = 25
표4. PCR 증폭을 위한 primer sequence = 42
표5. 탄소원 최적화에 따른 에탄올 생산량 = 57
표6. 질소원 최적화에 따른 에탄올 생산량 = 61
