Finding Regulatory Factors Binding to Rad50 Hypersensitivity Site 7 (RHS7) during T helper type 2 (Th2) cell differentiation
- 주제(키워드) T helper cell type 2 differentiation , RHS7 , Transcription factor
- 발행기관 서강대학교 대학원 생명과학과
- 지도교수 이갑열
- 발행년도 2009
- 학위수여년월 2009. 2
- 학위명 석사
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/sogang/000000044856
- 본문언어 영어
초록/요약
T helper cells coordinately control several immune responses. During T helper cells differentiation to Th1 or Th2 cells, differentiation-specific gene regulation is the key to determine the cell's fate. Previous studies have shown that Th2 locus control region (LCR) plays a major role as a cis-element which controls the expression of Th2 cytokines in Th2 cell differentiation. Th2 LCR is composed of 4 DNase I hypersensitive sites, RHS 4 to 7, among which RHS7 has been shown to play a critical role when a Th2 cell differentiates. I selected several putative transcription factor binding sites on RHS7 and performed electrophoresis mobility shift assay (EMSA). I found that Th2 cell specific binding on RHS7(2) and RHS7(11) sites (the site contains putative binding site for CCAAT/enhancer binding protein -alpha, beta, and Yin Yang 1, C/EBP-α, β and YY-1). Among these proteins, I found that YY-1 binds to RHS7(2) and RHS7(11) by EMSA, competition and supershift assay. To identify the protein(s) that bind to the RHS7(2) site, protein elutes were obtained from DNA affinity chromatography and subjected to mass spectrometry (M/S). L(3) mbt-like 2, one of the candidates from the M/S, showed Th2 specific increase of mRNA and protein level by quantitative RT-PCR and western blot. I am currently investigating these candidate proteins' functional role of these bindings.
more초록/요약
생체 내 면역 반응에서 T helper 세포는 여러 가지 면역반응을 통합하여 조절하는 기능을 가지고 있다. T helper 세포가 T helper type 1 (Th1) 또는 Th2 세포로 분화하는 과정에 수반되는 유전자 발현은 이러한 분화 기작을 결정하는 중요한 요소가 된다. 기존 연구에서 Th2 세포 분화시 cytokine의 발현을 조절하는 cis-element로 Locus Control Region (LCR)이 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 이 Th2 LCR은 RHS4에서 RHS7에 이르는 4개의 DNase I hypersensitive site (HS)로 구성되어 있으며, 이 HS는 Th2 세포 분화와 Th1, Th2 cytokine 발현에 큰 역할을 한다고 알려졌다. 그 중 RHS7 부위가 Th2 세포 분화에 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀져 있으므로, 이 RHS7과 상호작용하는 trans-acting factor가 중요한 역할을 할 것으로 예상된다. 따라서, 본 연구에서는 RHS7 부위에 결합 가능한 단백질 후보군을 데이터베이스 검색을 통해서 결정하였고, 여러 후보군들 중에서 Yin Yang 1 (YY-1)이 RHS7 (2)와 RHS7 (11) 부위에 Th2 세포 특이적으로 결합하는 것을 EMSA (electrophoresis mobility shift assay)와 competition과 supershift assay를 통하여 확인하였다. 또한 앞선 후보군과 DNA affinity chromatography를 통하여 얻은 후보군들 중에서 L(3) mbt-like 2가 Th2 세포 특이적으로 발현양이 증가함을 quantitative RT-PCR과 western blot을 통해 확인하였다.
more목차
1. Introduction = 1
2. Materials and Methods = 4
2.1 Sequence Homology Analysis = 4
2.2 Searching for DNA binding Factors = 4
2.3 Naive CD4+ T Cell Sorting and T Cell Differentiation = 4
2.4 Nuclear Protein Extraction = 5
2.5 Electrophoretic Mobility Shift Assays = 6
2.6 DNA Affinity Chromatography and Mass Spectrometry Analysis = 6
2.7 RNA isolation and qRT-PCR analysis = 7
2.8 Cell lysates preparation and Immunoblotting = 7
3. Results = 11
3.1 The homology between human and mouse RHS7 site and the prediction of RHS7 binding Transcription Factors = 11
3.2 Th2 cell specific binding appeared in RHS7(2) site = 14
3.3 Protein binding to C/EBP-β site = 16
3.4 DNA affinity chromatography and mass spectrometry analysis = 22
3.5 L3mbtl2 gene expression is higher in the Th2 cells = 26
3.6 Protein level of candidates have no significant differences in the helper cells' differentiation = 28
4. Discussion = 29
5. References = 32
