Characterization of Divalent Metal Inhibition in Cav2.3 and Cav3.2 Ca2+ Channels
- 발행기관 서강대학교 대학원
- 지도교수 이정하
- 발행년도 2008
- 학위수여년월 2008. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 생명과학과
- 식별자(기타) 000000108363
- 본문언어 영어
목차
Calcium influx via voltage-gated Ca2+ channels (VGCCs) increases intracellular Ca2+ concentration, mediating diverse physiological functions including cardiac pacemaker activity, hormone secretion, muscle contraction, and neuronal excitability. Molecular cloning and expression studies have revealed existence of ten pore-forming alpha1 subunits among which Cav3.1 (a1G), Cav3.2 (a1H), and Cav3.3 (a1I) are the members of a low voltage-activated (LVA) T-type Ca2+ channel subfamily. Different from high voltage-activated (HVA) Ca2+ channels, T-type Ca2+ channels activate at low threshold and show transient current kinetics due to fast activation and inactivation, and slow deactivation.
Early studies have reported controversial results that some T-type Ca2+ currents were selectively blocked by low doses of nickel, but other T-type Ca2+ currents were blocked by higher doses of nickel. Pharmacological analysis of T-type channel isoforms showed that Cav3.2 channel was sensitively inhibited by low doses of Ni2+, whereas the other T-type channels required higher doses of Ni2+ to be blocked.
In the present study, I investigated the structural element(s) responsible for the nickel inhibition on the Cav3.2 channels by constructing systematic chimeric channels between the nickel-insensitive Cav3.1 and the nickel-sensitive Cav3.2. Serial assays of chimeric channels localized the region responsible for nickel block to be between the N-terminus and S4 of domain I. Subsequent point mutation experiments identified that His191 located in the IS3-IS4 loop conferred the high nickel sensitivity to the Cav3.2 channel. I proposed a nickel inhibition mechanism in which nickel binding to His191 inhibited the gating of channels to the open state by interrupting the coupling between S4 and the pore.
Cav2.3 Ca2+ channels have been reported to be sensitively blocked by Ni2+. Comparison of amino acid sequences between the Cav2.3 channel and the Cav3.2 channel represents that two His residues (His179 and His 183) are located in the IS3-IS4 loop of the human Cav2.3 channel as in the Cav3.2. I demonstrated that both His179 and His 183 in the IS3-IS4 loop are involved in nickel sensitive inhibition of the human Cav2.3 channel using the combined tools of single point mutation and electrophysiology.
Zinc was also reported to sensitively inhibit Cav3.2 channel in which His191 located in the IS3-IS4 loop was identified to be a molecular determinant for the zinc-sensitive inhibition. Although the His residue was a critical residue for zinc inhibition, introduction of His to the counter locus of the zinc-insensitive Cav3.1 partially rendered zinc sensitivity to Cav3.1 mutant, suggesting involvement of unidentified residue(s) as well as the His residue. Using assay of serial mutant channels, I identified that Gly190 preceding His191 in the S3-S4 loop is another critical residue contributing to the zinc sensitivity of the Cav3.2.
목차
전위 활성화 칼슘통로를 통한 칼슘 이온의 유입은 세포 내 칼슘 농도를 증가시켜 심장의 페이스메이커의 활성, 호르몬 분비, 근육 수축, 그리고 신경 흥분성 등 다양한 생리적 기능을 매개한다. 분자 생물학적 클로닝과 이종 발현계 연구를 통해 현재까지 칼슘채널의 통로를 형성하는 10 종류의 alpha1 구조체가 알려졌으며, 이 중에서 Cav3.1 (a1G)와 Cav3.2 (a1H), Cav3.3 (a1I)는 T-형 통로의 세 가지 아형으로 밝혀졌다. 고전위 칼슘통로와 달리, T-형 칼슘통로는 낮은 역치에서 활성화되며, 빠르게 활성화되고 비활성화되는 전류의 키네틱스와 느리게 불활성화되는 꼬리전류를 갖는다.
초기 연구에서 T-형 칼슘 전류는 낮은 농도의 니켈에 의해 민감하게 차단됨이 보고되었지만, 이후 연구에서는 높은 농도의 니켈에 의해 차단되는 T-형 칼슘 전류들도 보고되었다. 최근의 클로닝된 세 T-형 채널 아형에 대한 니켈 민감성의 비교는 Cav3.2만이 낮은 농도의 니켈에 민감하게 차단되고, 다른 두 아형들은 높은 농도의 니켈에 의해 차단됨을 보임으로써 그 상반된 결과의 원인이 밝혀졌다.
본 연구에서는 니켈에 의해 민감하게 차단되는 Cav3.2와 상대적으로 덜 민감하게 차단되는 Cav3.1의 키메라를 제작하여 Cav3.2에 니켈 민감성을 결정하는 구조적 부위를 찾기 위한 연구를 수행하였다. 일련의 키메라를 제작 후 니켈 민감성을 비교한 결과, 니켈 민감성을 부여하는 부위는 Cav3.2의 첫 번째 도메인의 아미노말단에서 S4 사이로 좁혀졌으며, 점돌연변이 실험 결과 Cav3.2의 첫 도메인의 S3-S4 루프에 존재하는 191번째 히스티딘이 니켈 민감성에 중요한 부위임을 밝혔다. Cav3.2의 전류가 니켈이온에 차단되는 현상은 니켈이온이 191번째 히스티딘에 결합하여 S4 전위센서의 움직임을 억제하여 포어와의 커플링을 저해함으로써 발생하는 것으로 사료된다.
Cav2.3 칼슘통로 역시 낮은 농도의 니켈에 의해 민감하게 차단된다고 보고되었다. Cav3.2와 Cav2.3의 아미노산을 비교한 결과, Cav3.2와 유사하게 Cav2.3의 첫 도메인의 S3-S4 루프에 두 개의 히스티딘 (히스티딘 179와 히스티딘 183)이 존재함이 발견되었다. 두 히스티딘을 대상으로 각각을 점돌연변이 후 전기 생리학적 특성 파악과 니켈에 의한 차단성 측정을 수행한 결과, 두 히스티딘 모두 Cav2.3의 니켈에 의한 차단 민감성에 관여함을 밝혔다.
Cav3.2는 아연에 의해서도 민감하게 차단되며, 첫 도메인의 S3-S4 루프에 있는 191번째 히스티딘이 아연에 의한 차단 민감성을 결정하는 주요 부위임이 보고되었다. 하지만 히스티딘을 아연에 민감하지 않은 Cav3.1의 해당 부위에 도입하여도, 그 Cav3.1 돌연변이체의 아연에 의한 차단 민감성은 크게 향상되지 않았다. 이 결과는 히스티딘뿐만 아니라 다른 구조적 부위가 아연에 의한 차단 민감성에 관여함을 제시한다. 따라서, 히스티딘 이외에 아연에 의한 차단 민감성에 영향을 주는 부위를 Cav3.1와 Cav3.2 사이의 키메라와 돌연변이체들을 제작 후 아연에 의한 차단성을 조사했다. 그 결과 Cav3.2의 191번째 히스티딘과 더불어 190번째 글라이신이 아연에 의한 차단 민감성을 부여하는데 중요하게 작용함을 알 수 있었다.
