The arginine peptide as a novel siRNA delivery system
- 발행기관 서강대학교 대학원
- 지도교수 양재명
- 발행년도 2008
- 학위수여년월 2008. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 생명과학
- 식별자(기타) 000000107516
- 본문언어 영어
목차
Arginine peptides are a potent non-viral gene delivery system. In this study, we demonstrated that arginine peptides were an efficient delivery system of siRNA. In order to verify whether arginine peptides could effectively deliver siRNA to intracellular region, we performed gel shift assays using luciferase siRNA (lucsiRNA) and arginine peptides. The peptides/siRNA complex formation was measured based on molar ratios between amino groups (NH3+, N) in arginine peptides and phosphates (PO4-, P) in siRNA. From this result, we observed gel retardation from N/P ratio 0.5 while no bands were detected when the ratio reached 3. It indicated that, as N/P ratio increased, the complex’s size and positive charges also increased. With this result, we performed RNAi assay using Cos-7 cell lines and derived 20%-40% luciferase inhibition at various N/P ratios. At the N/P ratio 3, in particular, we observed the maximum inhibition effect (IC50). It indicated that siRNA inhibition was the most effective at N/P ratio 3 where optimal complex formation was achieved for inhibition activity. We focused on establishing optimal transfection condition to obtain expected inhibition results through experiments of time course inhibition and siRNA amount effect. Only complexes of N/P ratio 3 were used for this purpose. As a result, we concluded that luciferase Inhibition was the most active around 24 hours and the half maximal inhibition of target gene activity occurred at the concentration of 0.1-0.15 ㎍lucsiRNA. It indicated that peptides/siRNA complexes were dissociated actively around 24 hours from transfection. We also studied arginine peptides/siRNA internalization mechanisms conducting confocal laser scanning microscope (CLSM) and the effect of endosomolytic reagent, chloroquine. For CLSM observation, Cy3 labeled lucsiRNA and FITC tagged arginine peptides were prepared. After 3 hours of post-transfection, complexes were placed inside the cells, especially around the nucleus. After 24 hours of post-transfection, lots of signals were generated from Cy3 labeled lucsiRNA and the signals were observed until 72 hours of post-transfection. It demonstrated that complexes are dissociated at certain time periods and siRNA works around the nucleus. It also supports the time course inhibition results which demonstrate that the inhibition activity was the most effective in the 24 hour time period. We treated chloroquine, an endosomolytic reagent, into Cos-7 cells to identify the internalization mechanism of arginine peptides/lucsiRNA complexes. The results showed that complexes did not take endosome pathway for delivery into the cells. Based on results, we showed the potential of arginine peptides as an effective and safe gene delivery system in vitro and in vivo also.
목차
아르기닌 펩타이드는 유전자 전달 시스템으로 주목을 받고 있는 비바이러스성 수송체 중의 하나이다. 본 연구에서는 아르기닌 펩타이드가 새로운 치료물질로 주목 받고 있는 siRNA를 세포 내부에 효과적으로 전달할 수 있는지의 여부를 알아보았다. 먼저, 펩타이드의 아미노기 (NH3+, N)와 siRNA의 인산기 (PO4-, P)의 몰비율 (N/P ratio)을 바탕으로 복합체를 형성할 수 있는지 gel shift assay를 통해 알아보았다. 이를 바탕으로 Firefly luciferase를 억제할 수 있는 luciferase siRNA (lucsiRNA)와 이를 수송할 수 있는 아르기닌 펩타이드 간에 다양한 N/P ratio를 통해 복합체를 형성하였다. 몰비율 0.5부터 젤 상에서 밴드끌림 현상이 관찰 되었으며3부터는 젤 상에서 밴드가 관찰되지 않았다. 이것은N/P ratio가 높아질수록 펩타이드와 siRNA가 형성하는 복합체의 크기와 양이온성이 커짐을 의미한다. 이 복합체를Cos-7 세포에 처리한 결과 N/P ratio에 따라20%-40% 정도의 luciferase activity 억제율을 보였으며 그 중 N/P ratio 3에서 약 40%의 억제율을 나타내었다. 이것을 바탕으로 가장 효과적인 트렌스펙션 조건을 설립하기 위해 시간 경과에 따른 억제효과와 siRNA의 양의 변화에 따른 억제효율을 조사하였다. N/P ratio 3인 복합체를 사용한 실험결과 트렌스펙션 24시간 후에 luciferase의 억제양상이 가장 활발하게 나타났으며 siRNA양은 0.1-0.15㎍에서 IC50 (half maximal inhibitory concentration) 을 도출할 수 있었다. 이것은 24시간을 전후하여 siRNA의 작용이 매우 활발하다는 것을 의미한다. 또한, siRNA의 양이 줄어들수록 억제율도 줄어드는 것을 통해 타겟하는 특정 유전자의 발현을 억제하는 효율에 siRNA의 양이 영향을 주는 것을 알 수 있다. 세포 내 복합체의 이동 경로를 규명하기 위하여 콘포컬 현미경을 통해 시간대별 이동양상을 관찰 하였으며endosomolytic reagent인 chloroquine을 세포에 처리하여 복합체가 엔도싸이토시스에 의한 이동인지를 실험하였다. 복합체의 세포 내 이동 관찰을 위해Cy3가 부착된 lucsiRNA와 FITC가 붙어있는 아르기닌 펩타이드를 사용하였다. 트랜스펙션 3시간 후부터 복합체가 세포 내부에 위치하는 것을 볼 수 있었으며 주로 핵 주변 부위에 위치하고 있는 것을 볼 수 있었다. 트렌스펙션 24시간 후부터는 복합체가 분리되어 lucsiRNA의 신호가 주로 관찰 되었으며 72시간대에는 lucsiRNA의 신호만 핵 주변 부위에서 관찰되었다. 이것은 siRNA와 결합한 아르기닌 펩타이드가 일정 시간이 지난 후 세포 내에서 분리되며 siRNA는 핵 주변 부위에서 작용한다는 것을 말해준다. 또한 이러한 관찰 결과는 시간대별 억제양상에서 24시간 대에 가장 활발한 억제율을 보인 실험결과를 지지해 준다. 복합체의 이동 메커니즘으로 생각되는 엔도싸이토시스 현상을 확인하기 위해 엔도좀을 깨는 chloroquine을 사용한 실험을 하였다. Chloroquine을 처리한 실험군과 처리하지 않은 대조군에서는 억제효율에서 비슷한 양상을 나타냈다. 이것은 복합체의 세포 내 이동 메커니즘은 엔도좀을 이용한 것이 아니라는 것을 의미한다. 이러한 실험 결과를 통해 아르기닌 펩타이드는 siRNA를 세포 내로 전달할 수 있는 수송체임을 알 수 있으며 in vivo에서도 효과적인 수송체로 사용될 수 있는 가능성을 보여주고 있다.
